Система контакт: Денежные переводы CONTACT

Naumen Contact Center — высокая надежность, доступная цена, любые задачи

Naumen Contact Center — комплексное программное решение, содержащее все необходимое для организации корпоративного или аутсорсингового
контакт-центра. Создавая call center на базе нашего решения, вам не придется тратиться на интеграцию и поддержку
продуктов от разных поставщиков, поскольку в Naumen Contact Center есть все, что необходимо для эффективной работы.

В состав решения входит коммуникационная платформа с компонентом Omni-Channel, обеспечивающая работу
телефонии, а также прием и обработку обращений по другим каналам: e-mail, SMS, мессенджеры, соцсети, звонки с сайта, чат на сайте и в мобильном приложении.

С точки зрения функциональности, надежности, гибкости, масштабируемости и уровня техподдержки платформа Naumen Contact Center соответствует высоким требованиям корпоративного сегмента. Решение использует SIP-протокол, что позволяет подключать VoIP-шлюзы и абонентские терминалы различных производителей, предоставляя полную свободу выбора серверного и телекоммуникационного оборудования.

Серверная часть NСС работает на базе свободно распространяемого ПО: ОС Linux, а в качестве СУБД может быть использован PostgreSQL или Oracle. На рабочих местах допускается использование разных операционных систем Windows, Linux и MacOS.

Технологическая зрелость платформы Naumen Contact Center подтверждена многочисленными
победами в рамках престижных профессиональных конкурсов, среди которых 8 наград конкурса «Хрустальная Гарнитура»
в номинациях «Продукт года», «Лучший продукт», «Лучшее применение технологий», и др.
По данным независимых исследований РБК Research и IKS Consulting начиная c 2014 года NAUMEN занимает лидирующие позиции
по количеству внедренных решений в сегменте аутсорсинговых контактных центров, опережая Avaya, Cisco и Genesys. Помимо
ведущих аутсорсинговых контакт-центров решения на платформе NAUMEN используют многие крупные компании, среди которых Ростелеком,
Почта России, Мосэнергосбыт, ОТП Банк, Банк РОССИЯ, ЭРА ГЛОНАСС, Ягуар Лэндровер, Спортмастер, СТД Петрович, Сбербанк АСТ, Belka Car и другие известные бренды.

Информационная система «Единый контакт-центр» — Connect-WIT

ТЕМАТИКА ПРОДУКЦИИ

 Интерактивный контакт-центр

 НАИМЕНОВАНИЕ

 Информационная система «Единый контакт-центр»

 ПРОИЗВОДИТЕЛЬ

 САТЕЛ

 ПОСТАВЩИК

САТЕЛ

 ИСТОЧНИК (URL)

https://satel.org/solutions/programmnye-produkty/

НАЗНАЧЕНИЕ 

• Повышение качества обслуживания клиентов в режиме реального времени по различным каналам связи.
• Консолидация поступающих по различным каналам связи запросов в единый центр приема и обработки обращений.
• Автоматическая обработка части поступающих вопросов с использованием алгоритмов искусственного интеллекта и речевых технологий.
• Ведение экспертной системы (базы знаний) на основе обобщения и анализа поступающих запросов.

ХАРАКТЕРИСТИКИ И ПРЕИМУЩЕСТВА

 Единый контакт-центр – уникальный продукт, не имеющий аналогов на российском рынке программного обеспечения. Решение полностью базируется на отечественных решениях, что отвечает требованиям по ведению политики импортозамещения. Единый контакт-центр САТЕЛ – это цифровое технологическое решение, в котором используются современные средства автоматизации для дистанционной обработки обращений.

ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ВОЗМОЖНОСТИ 

Функциональные блоки ИС ЕКЦ:

• Платформа унифицированных коммуникаций
• Омниканальная платформа обработки вызовов (Контакт-Центр)
• Единое окно оператора контакт-центра
• Чат-бот
• Экспертная система (база знаний)
• Система регистрации и записи событий

Архитектура нового решения САТЕЛ включает в себя как стандартный набор функциональных блоков контакт-центра (АРМ, CRM, IVR, система исходящих кампаний, видеовызовы и др.), так и дополнительные возможности наиболее эффективного взаимодействия с клиентами: ведение экспертной системы для автоматизированного хранения базы знаний и компетенций, использование технологий голосовой аналитики для автоматического контроля качества на основании транскрипций записей и эмоциональной окраски, использование технологий искусственного интеллекта для реализации сценариев самообслуживания в контакт-центре. Таким образом, разработанный продукт не только автоматизирует работу операторов, повышая тем самым эффективность контактного центра в целом, но и сокращает время ответа на запрос клиента без потери качества предоставляемой информации.

«САТЕЛ», +7 495 785-88-77, [email protected]

«Ростелеком» организовал единый контакт-центр по мерам социальной поддержки граждан

13 Октября 2021 16:2113 Окт 2021 16:21

|

Поделиться

«Ростелеком» совместно с Пенсионным фондом России (ПФР) организовал единый контакт-центр взаимодействия с гражданами, в котором можно получить информацию по вопросам, связанным с мерами социальной поддержки. Для этого необходимо позвонить по телефону или отправить запрос в чат. Единый контакт-центр призван автоматизировать обращения граждан, предоставить дистанционные услуги, повысить качество обслуживания и удовлетворенность граждан.

Контакт-центр ПФР — единая информационная система ведомств социального блока, включающая также Фонд социального страхования России, учреждения медико-социальной экспертизы (МСЭ), Федеральную службу по труду и занятости (Роструд) и Министерство труда и социальной защиты России. Планируется подключение и органов социальной защиты субъектов РФ. В настоящее время единый контакт-центр запущен в десяти пилотных регионах, в дальнейшем планируется масштабирование по всей стране.

Для реализации масштабного проекта в информационную систему контакт-центра внедрены компоненты единой диалоговой платформы, в том числе голосовой и текстовый бот и речевая аналитика. В проекте реализовано более 100 сценариев самообслуживания. Бот одновременно обрабатывает свыше 800 сессий (голосовых и текстовых запросов клиентов). На момент запуска было автоматизировано 15% обращений граждан.

В ближайшее время планируется автоматизировать 30% обращений граждан, повысить качество обслуживания, добавить персональные консультации, реализовать запись на прием. В области речевой аналитики будут развиваться автоклассификация и динамическая отчетность на основе созданных маркеров и скриптов.

CRM-системы автоматизация контакт-центра — НОРБИТ

Решение

Комплексное решение позволяет хранить данные всех клиентов в единой базе, управлять работой менеджеров\операторов, получать актуальную информацию по сделкам в реальном времени.

Решение автоматически идентифицирует клиента при входящем звонке и фиксирует время разговора.

Сотрудникам удобно принимать звонки и видеть основную информацию по звонкам в CRM, быстро заполнять данные по клиентам и обращениям во время звонков, консультировать клиентов с использованием информации многоуровневой базы знаний использовать функциональность единого окна.

РЕЗУЛЬТАТЫ:

• Повышение качества обслуживания и лояльности клиентов, отсутствие потерянных обращений, сделок и клиентов.
• 
  Сокращение времени принятия управленческих решений за счет актуальных данных и уменьшение среднего времени звонка.
• 
  Объективный контроль и мотивация работы операторов.
• 
  Повышение эффективности проведения маркетинговых кампаний.

Услуги

Услуги НОРБИТ:

   Написание технического задания и настройка системы.

   Ввод системы в опытную и промышленную эксплуатацию.

   Доработка стандартных программ.

   Разработка дополнительных программных комплексов.

   Интеграция с внешними системами.

   Поддержка и сопровождение.

Контактная система — PubMed

Цели:

Изучить литературу по состояниям, заболеваниям и расстройствам, которые влияют на активность контактных факторов, а также изучить литературу на предмет доказательств того, что меньшая, чем обычно, активность любого из контактных факторов может быть связана с тромбофилией.

Источники данных:

MEDLINE выполняет поиск англоязычных статей, опубликованных с 1988 по 2001 год, и соответствующих ссылок, содержащихся в них, а также поиск ссылок в недавних соответствующих статьях и обзорах.

Выбор исследования:

Соответствующая клиническая и лабораторная информация была извлечена из выбранных статей. Мета-анализ был невозможен из-за неоднородности отчетов.

Извлечение и синтез данных:

Были исследованы доказательства связи измененных уровней контактных факторов и тромбофилии.Большое разнообразие нарушений связано со снижением активности контактных факторов; Основными среди этих заболеваний являются заболевание печени, незрелость печени у новорожденных, антифосфолипидный синдром, а для фактора XII — азиатское происхождение. Эти нарушения встречаются чаще, чем гомозиготный дефицит. Немногочисленные серии и отчеты о случаях тромбофилии у пациентов, гомозиготных по дефициту контактных факторов, недостаточно убедительны, чтобы подтвердить причинно-следственную связь. Очевидная связь между уровнями, соответствующими гетерозиготности (40-60% от нормы) любого из контактных факторов (но особенно фактора XII) у лиц с антифосфолипидными антителами, по-видимому, связана с ложно сниженными уровнями активности этих факторов in vitro, которые являются нормальными при антигенном тестировании.Очевидная связь с тромбозом лучше объясняется антифосфолипидным синдромом, чем умеренным снижением уровней контактных факторов.

Выводы:

В настоящее время не рекомендуется измерять активность контактных факторов при рутинном обследовании пациентов, перенесших венозную или артериальную тромбоэмболию или острый коронарный синдром.

Кристаллизация нашего взгляда на контактную систему | Кровь

Как система контактной активации (CAS) собирается на ячеистых поверхностях? Хотя исследователи изучали контактные факторы прекалликреин (PK), высокомолекулярный кининоген (HK) и фактор XII (FXII) и их соответствующие роли в воспалении, иммунитете и коагуляции более полувека, теперь мы получаем некоторая ясность в отношении четвертичной структуры этого увлекательного мультиферментного комплекса.В этом выпуске Blood Кайра и его коллеги описывают первую кристаллическую структуру домена FXII в комплексе с предполагаемым рецептором, и они предлагают модель, с помощью которой этот связывающий белок, рецептор глобального комплемента C1q (gC1qR), может действовать как шаперон для объединения контактных факторов в группу до инициации фактора XI (FXI) -зависимого свертывания крови и высвобождения воспалительного брадикинина (BK). ¹

Интерес к CAS значительно расширился в последние годы, поскольку контактные факторы в настоящее время исследуются в качестве терапевтических мишеней для тромботических и воспалительных состояний.Действительно, было показано, что ингибиторы PK, HK и FXII ограничивают экспериментальный тромбоз без увеличения кровотечения на животных моделях, ² , тогда как ранние исследования на людях показали, что нацеливание на FXI является антитромботическим без признаков значительного гемостатического действия. компромисс. ³ Мутации с усилением функции FXII также описаны, которые вызывают редкое воспалительное заболевание наследственный ангионевротический отек с нормальным ингибитором C1. ⁴ Несомненно, множество биологических активностей, связанных с CAS, открывают возможности для новых подходов к уменьшению тромбоза и воспаления при различных болезненных состояниях.

Учитывая его многочисленные функции в растущем списке заболеваний, gC1qR также стал потенциальной мишенью для терапевтических разработок. gC1qR — это повсеместно экспрессируемый высокоанионный многофункциональный белок, который играет важную роль в инфекциях, воспалениях, а также в прогрессировании и метастазировании рака. ^5,6 gC1qR, как было показано, связывает множество белков на поверхности клетки, в плазме и на патогенных микробах, тогда как белки плазмы, которые связываются с gC1qR, в основном относятся к CAS, а также к фибриногену, тромбину, и мультимерный витронектин. ^7,8 Это предполагает, что gC1qR может участвовать в образовании фибрина, особенно в местах иммунного повреждения и / или воспаления. Тем не менее, для того, чтобы в дальнейшем разграничить конкретные последующие виды деятельности, мы должны лучше понять взаимосвязь структура-функция, которая позволяет рационально проектировать аллостерические модуляторы.

Открытия Kaira et al обеспечивают основу для потенциального пути вперед, а также предлагают понимание того, как CAS может взаимодействовать с другими рецепторами и поверхностными инициаторами, способствуя свертыванию и воспалению (см. Рисунок).Используя кристаллографию, поверхностный плазмонный резонанс и анализы коагуляции на основе плазмы, авторы определили специфические остатки и кофакторы, которые необходимы для сборки комплекса HK / FXII / gC1qR, а также показали, что gC1qR способствует FXII-зависимой коагуляции. Эксперименты по гель-фильтрации впервые показывают, что одновременное связывание HK и FXII происходит как часть этой сборки с gC1qR, объединяющей FXII и HK в тройной комплекс более высокого порядка. Исследования мутагенеза также идентифицируют критический компонент тримера gC1qR, который предполагает стерическую окклюзию как механизм асимметричного связывания HK.

Воздействие на кровь различных отрицательно заряженных веществ или искусственных поверхностей запускает протеолитическую активацию CAS, которая приводит к образованию тромбина, образованию фибрина и воспалительному высвобождению BK. Обычно события коагуляции изображаются как последовательный каскад ферментативных стадий и путей. Представленное здесь исследование показывает, что четвертичные стриктуры более высокого порядка мультиферментных комплексов, вероятно, играют центральную роль в повышении каталитической эффективности многих взаимодействий факторов свертывания крови.Действительно, поскольку FXI является гомологом PK, который также циркулирует в комплексе с HK, ⁹ и FXI, как было показано, реципрокно активируют FXII, ¹⁰ предложенная модель может напрямую связывать инициированную CAS активацию FXI и последующую коагуляцию. Хотя эта статья завершает давнюю дискуссию о том, как собираются контактные факторы по отношению к gC1qR, необходимы дополнительные исследования для изучения относительной важности других предполагаемых рецепторов / кофакторов, таких как рецептор урокиназы или цитокератин 1, в модуляции CAS.

Раскрытие информации о конфликте интересов: E.I.T. является сотрудником и акционером Aronora, Inc. E.I.T. и Орегонский университет здоровья и науки (OHSU) имеют значительную финансовую заинтересованность в Aronora, Inc., компании, которая разрабатывает ингибиторы FXI и контактных систем. Этот потенциальный конфликт интересов был рассмотрен и разрешен Комитетом по конфликту интересов в исследованиях OHSU.

Пенициллин вызывает неаллергическую анафилаксию, активируя контактную систему

Контактная система, управляемая FXII. Контакт с отрицательно заряженными …

Контекст 1

… образование может быть инициировано двумя различными путями, либо энзимология контактной системы, управляемой FXII, in vitro хорошо запускается воздействием крови на поврежденный сосуд стена (внешняя) понял.Однако его вклад in vivo только начинается или влияет на внутренние (внутренние) факторы. Внутренний путь возникновения. Активация FXII-контакта in vitro обеспечивает механическую коагуляцию, инициированную фактором XII (FXII, фактор Хагемана), в основе одной из наиболее часто используемых диагностических реакций свертывания крови с участием высокомолекулярного кининогена (HK) и тестов, активированного частичного тромбопластина. время (АЧТВ), которое представляет собой калликреин плазмы (ПК). Эти факторы в совокупности называют широко используемыми в клинической практике (500 миллионов анализов в год на систему контакта с плазмой.1-6 Контакт с отрицательно заряженными по всему миру) для предоперационного скрининга, диагностика поверхностей вызывает конформационные изменения при аутоиммунных заболеваниях, связанных с тромбозом зимогена FXII, и мониторинг антикоагулянтов, что приводит к небольшому количеству активного FXII (FXIIa). 7 FXIIa расщепляет агуляционную терапию. Несмотря на его вклад в образование PK фибрина для генерации активного PK, который, в свою очередь, реципрокно активирует in vitro, инициированная FXII коагуляция in vivo не считалась FXII. 8 FXIIa запускает образование фибрина через активацию значимого фактора.Эта предпосылка основана на наблюдении, что XI (FXI), а также высвобождает медиатор воспаления брадикинин FXII-дефицитные люди и животные не проявляют клинически (BK) от HK через расщепление PK. 3 Связывание BK с соответствующим фенотипом кровотечения: люди с частичным или тяжелым FXII кининовым рецептором B2 (B2R) активируют провоспалительный дефицит передачи сигналов, не кровоточат чрезмерно из участков повреждения, несмотря на то, что пути, которые расширяют сосуды, вызывают хемотаксис нейтрофилов и заметное удлинение АЧТВ.12,13 Это очевидное несоответствие увеличивает проницаемость сосудов. 9 Таким образом, управляемый FXIIa контакт между важной ролью FXII в контактно-управляемой фибриновой системе имеет провоспалительную и прокоагулянтную активности за счет образования в пробирках, которые в конечном итоге не имеют корреляции in vivo калликреин-кининовой системы и внутреннего пути коагуляции, озадаченные исследователями. в течение многих десятилетий. Аналогично дефициту FXII, соответственно (рис. 1). Ингибитор серпин-С1-эстеразы (C1INH), у которых отсутствуют контактные белки PK или HK, является основным плазменным ингибитором FXIIa и PK и контролирует нарушение гемостаза и обычно диагностируется во время рутинной протеолитической активности контактной системы.10 Помимо C1INH, скрининг коагуляции при обнаружении пролонгированного АЧТВ. В антитромбине III (ATIII) и PAI-1 также есть контраст, блокирующий FXIIa, пациенты с дефицитом FXI обладают легкой активностью, вызванной травмой. 11 In vitro FXIIa запускает активацию классического нарушения свертываемости крови (иногда называемого «гемофилией С»), которое в основном является путем, и запускает фибринолитическую систему через PK-опосредованную, ограниченную тканями с высокой фибринолитической активностью. Тяжелая активация урокиназы FXI. 5 Способен ли FXIIa вызывать дефицит — это редкая наследственная аномалия в общей популяции, активирующая системы комплемента и фибринолитической системы in vivo (наблюдаемая при распространенности 1 на миллион человек), но более распространенная, остается неясной.в определенных группах населения, таких как евреи-ашкенази (1 из 450). 14 Энзимология контактной системы, управляемой FXII, in vitro хорошо изучена. Однако его вклад in vivo только начинает проявляться. Активация FXII-контакта in vitro обеспечивает механическую основу для одного из наиболее часто используемых диагностических тестов свертывания крови, активированного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ), которое широко используется в клинической практике (500 миллионов тестов в год во всем мире) для предоперационного скрининга. , диагностика аутоиммунных заболеваний, связанных с тромбозами, и мониторинг антикоагулянтной терапии.Несмотря на его вклад в образование фибрина in vitro, коагуляция, инициированная FXII, in vivo не считалась важной. Эта предпосылка основана на наблюдении, что люди и животные с дефицитом FXII не проявляют клинически значимого фенотипа кровотечения: у лиц с частичным или тяжелым дефицитом FXII не наблюдается чрезмерного кровотечения из участков повреждения, несмотря на заметное удлинение аЧТВ. 12,13 Это очевидное несоответствие между важной ролью FXII в контактном образовании фибрина в пробирках, которое в конечном итоге не имеет корреляции in vivo, на протяжении десятилетий озадачивало исследователей.Подобно дефициту FXII, люди, у которых отсутствуют контактные белки PK или HK, не имеют нарушения гемостаза и обычно диагностируются во время рутинного скрининга коагуляции, когда обнаруживается длительное aPTT. Напротив, пациенты с дефицитом FXI имеют легкое нарушение свертываемости крови, вызванное травмой (иногда называемое «гемофилией С»), которое в основном ограничивается тканями с высокой фибринолитической активностью. Тяжелый дефицит FXI — редкая наследственная аномалия среди населения в целом (встречается с распространенностью 1 на миллион человек), но чаще встречается в определенных группах населения, таких как евреи-ашкенази (1 из 450).14 Это отсутствие тенденции к кровотечениям, наблюдаемое при дефиците FXII, резко контрастирует с недостатками других компонентов каскада свертывания, таких как FVII, тканевый фактор (TF) и FVIII или FIX (вызывающие гемофилию A и B, соответственно, гемофилию A и B). и привела к разумной гипотезе о том, что образование фибрина in vivo инициируется в значительной степени, если не исключительно, через внешний путь коагуляции. Примечательно, что полное устранение экспрессии TF вызывает внутриматочное эмбриональное кровотечение у мышей.Дефицит TF у человека не описан, что указывает на то, что TF необходим для развития и / или выживания. 15 Доминирующая роль управляемой VIIa / TF коагуляции для гемостаза подтверждается «пересмотренной моделью коагуляции», которая показывает, что FXI, субстрат FXIIa во время инициируемого контактом свертывания, также может активироваться тромбином, независимо от FXII. 16 Хотя FXII незаменим для образования фибрина в гемостатических реакциях, серьезные дефициты (≥ 10% от нормального уровня в плазме) коагуляционного белка неизменно редки, 17 предполагая, что FXII играет важную роль, что требует будущих исследований.Интересно, что FXII — довольно современный белок с точки зрения эволюции. Копии гена FXII отсутствуют у позвоночных млекопитающих, таких как птицы или рыбы, 18 которые имеют замкнутую систему кровообращения, что подтверждает мнение о том, что FXII не требуется для герметизации повреждений сосудов. Повреждение кровеносного сосуда вызывает активацию тромбоцитов и системы свертывания плазмы, что приводит к образованию тромба, состоящего из тромбоцитов и фибрина. Чтобы исследовать роль FXII in vivo, мышей FXII Ϫ / были получены и охарактеризованы на экспериментальных моделях тромбоза.19,20 Как и люди с дефицитом FXII, мыши FXII Ϫ / обладают нормальной гемостатической способностью, оцененной с помощью анализа кровотечения из хвоста, и могут подвергаться хирургическим процедурам без чрезмерного кровотечения. 21 Совершенно неожиданно, прижизненная флуоресцентная микроскопия и измерения кровотока в 3 различных артериальных руслах выявили серьезный дефект тромбообразования у мышей с дефицитом FXII при воздействии химического (FeCl 3), механического и розового …

Регулирование комплемента и Активация контактной системы посредством усиления ингибитора C1 и модуляции активности фактора XIIa с помощью сульфатированных гликанов — взаимосвязь структура-активность

Abstract

Ингибитор серпина C1 (C1-INH) является единственным регулятором классической активации комплемента, а также основным регулятором контактной системы.Его важность демонстрируется наследственным ангионевротическим отеком (НАО), тяжелым заболеванием с потенциально опасными для жизни приступами из-за дефицита или дисфункции C1-INH. Замещение C1-INH является терапией выбора при HAE. Кроме того, было показано, что C1-INH оказывает благотворное влияние при других заболеваниях, характеризующихся несоответствующей активацией комплемента и контактной системы. Из-за некоторых ограничений его клинического применения существует потребность в повышении эффективности терапевтически применяемого C1-INH или в усилении активности эндогенного C1-INH.Учитывая известный потенцирующий эффект гепарина на C1-INH, сульфатированные гликаны (SG) могут быть такими кандидатами. Цель этого исследования состояла в том, чтобы охарактеризовать подходящую SG путем оценки взаимосвязи структура-активность. Для этого более 40 структурно различных SG были исследованы на предмет их влияния на C1-INH, C1s и FXIIa. Оказалось, что SG усиливает ингибирование C1s посредством C1-INH без какого-либо прямого влияния на C1s. Доказано, что их потенцирующая активность зависит от степени сульфатирования, молекулярной массы, а также от структуры гликанов.Напротив, SG не влиял на ингибирование FXIIa C1-INH, но структурно модулировал активность FXIIa. Среди испытанных SG β-1,3-глюкановые сульфаты с M _r ≤ 10 000 были определены как наиболее многообещающие ведущие кандидаты для разработки усилителя C1-INH на основе гликана. В заключение, полученная информация о структурных характеристиках SG, способствующих потенцированию C1-INH, представляет собой полезную элементарную основу для разработки соединений, улучшающих эффективность C1-INH при заболеваниях и клинических ситуациях, характеризующихся несоответствующей активацией комплемента и контактной системы.

Образец цитирования: Schoenfeld A-K, Lahrsen E, Alban S (2016) Регулирование активации комплементарной и контактной системы посредством усиления ингибитора C1 и модуляции активности фактора XIIa сульфатированными гликанами — взаимосвязь структура-активность. PLoS ONE 11 (10):
e0165493.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0165493

Редактор: Саймон Дж. Кларк, Манчестерский университет, ВЕЛИКОБРИТАНИЯ

Поступила: 2 августа 2016 г .; Дата принятия: 12 октября 2016 г .; Опубликовано: 26 октября 2016 г.

Авторские права: © 2016 Schoenfeld et al.Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Доступность данных: Все соответствующие данные находятся в документе и его файлах с вспомогательной информацией.

Финансирование: Мы признательны земле Шлезвиг-Гольштейн за финансовую поддержку в рамках программы финансирования Open Access Publikationsfonds.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что никаких конкурирующих интересов не существует.

Введение

Ингибитор C1 (C1-INH) является членом семейства серпиновых ингибиторов протеаз и основным регулятором ряда сериновых протеаз системы комплемента, контакта и свертывания крови человека [1,2]. Эти плазматические каскадные системы тесно связаны друг с другом и являются частью врожденного иммунитета, необходимого для адекватного иммунного ответа [2]. Однако неправильное регулирование вызывает воспаление и нацеливание на собственные ткани и участвует в многочисленных заболеваниях, включая аутоиммунные заболевания (например,грамм. системная красная волчанка), ишемический / реперфузионный синдром, сепсис, возрастные дегенеративные заболевания, отторжение трансплантата, атеросклероз, диабет, тромботические микроангиопатии, тромбоэмболические заболевания, воспалительные заболевания (например, ревматоидный артрит) и рак [2–4].

В системе комплемента C1-INH является одним из нескольких растворимых и мембраносвязанных регуляторных белков, однако единственный ингибирующий начальную активацию системы комплемента, которая может происходить тремя разными путями, т.е.е. (1) классический путь (CP), в основном инициируемый комплексами антител, (2) лектиновый путь (LP), который активируется углеводами или N -ацетилированными группами на микробных поверхностях, и (3) альтернативный путь (AP ), который запускается посторонними поверхностями и функционирует как так называемая петля усиления [5].

C1-INH инактивирует инициирующие ферменты C1r и C1s CP [6] и сериновые протеазы MASP-1 и MASP-2 LP, связывающие маннан, лектин путем образования ковалентной связи [7,8].Кроме того, предполагается, что C1-INH ингибирует AP за счет обратимого связывания C3b и, следовательно, по несерпиновому механизму [9]. Таким образом, C1-INH уменьшает последствия активации комплемента, включая образование провоспалительных анафилатоксинов, особенно C5a, и, наконец, образование комплекса мембранной атаки (MAC), который приводит к лизису чужеродных клеток.

Помимо своей роли в системе комплемента, C1-INH также является первичным регулятором контактной системы, инактивируя плазменные протеазы контактной системы / внутренней коагуляции калликреин, фактор XIIa (FXIIa) и фактор XIa (FXIa) [10].Таким образом, он регулирует образование брадикинина, а также внутренний путь коагуляции. Более того, было обнаружено, что C1-INH оказывает ингибирующее действие также на другие протеазы, включая тромбин, плазмин и тканевый активатор плазминогена [1].

В целом, C1-INH способствует перекрестному связыванию между системой комплемента, контактной системой, коагуляцией и фибринолизом [10].

Физиологическое значение C1-INH отражается в его связи с различными заболеваниями, включая наследственный и приобретенный ангионевротический отек (HAE, AAE) с потенциально опасными для жизни приступами подкожных и подслизистых отеков [11] и возрастной дегенерацией желтого пятна (AMD). являясь ведущей причиной слепоты у пожилых людей в развитых странах [12].При HAE мутации в гене SERPING1, кодирующем C1-INH (HAE типа I или II) [13], и в гене FXII (HAE типа III) [14,15], приводят к недостаточной регуляции системы калликреин / кинин и, таким образом, к повышенный уровень брадикинина, вызывающий типичные симптомы, такие как отек мягких тканей, из-за его функции как сильнодействующего вазодилататора [16,17].

Замена

C1-INH концентратами C1-INH, полученными из плазмы (Berinert ^® P, Cinryze ^® ), по-прежнему является терапией выбора как при неотложной помощи, так и при профилактическом лечении HAE [18].Только для лечения острых приступов в последние годы были одобрены еще три препарата: конестат альфа (Ruconest ^® ), рекомбинантный человеческий C1-INH, полученный из молока трансгенных кроликов, икатибант (Firazyr ^® ), блокирующий декапептид. рецептор брадикинина B2 и рекомбинантный ингибитор калликреина экаллантид (Kalbitor ^® ), рекомбинантный белок, избирательно ингибирующий калликреин (по соображениям безопасности недоступен в ЕС) [18–20]. Однако использование как C1-INH, так и других препаратов имеет ограничения [21–23]: высокая стоимость терапии, ограниченные ресурсы человеческой плазмы в случае полученного из плазмы C1-INH, риск иммунологических побочных эффектов и, наконец, разрешено лишь частично, что затрудняет самоуправление.

Это также может быть препятствием для применения C1-INH по другим показаниям, хотя клинические исследования показали положительные эффекты C1-INH также при других болезненных состояниях, таких как сепсис, грамотрицательный эндотоксический шок, синдром утечки сосудов, отторжение трансплантата, ишемия- реперфузионное повреждение, инфаркт миокарда и экстренное аортокоронарное шунтирование [24,25].

Следовательно, все еще существует потребность в улучшении заместительной терапии C1-INH и в альтернативах C1-INH.На этом этапе потенцирующее действие гепаринов и некоторых других сульфатированных соединений на C1-INH, которое известно давно [26], приводит к идее, что сульфатированные гликаны (SG) могут быть кандидатами на повышение эффективности терапевтически применяемых препаратов. C1-INH или для увеличения активности эндогенного C1-INH.

Усиливающий эффект C1-INH нефракционированного гепарина (UFH) [26] был подтвержден in vivo увеличением комплексов C1rs-C1-INH в крови пациентов, перенесших коронарное шунтирование с использованием покрытых гепарином поверхностей [27].Кроме того, было проанализировано ограниченное количество других SG in vitro, , но с разными результатами. В одном исследовании сульфаты декстрана (DexS) с разной молекулярной массой потенцировали ингибирование C1s с помощью C1-INH даже сильнее, чем UFH [28], тогда как другие обнаружили, что эффект потенцирования C1-INH меньше, чем у UFH [26]. Гликозаминогликаны (ГАГ), гепарансульфат (HS) и хондроитинсульфат (CS) были постоянно менее активны, чем UFH, или даже неактивны [28-30], тогда как было показано, что гиперсульфатированный хондроитинсульфат (OSCS) увеличивает связывание C1-INH с C1s. сильнее, чем UFH [30].Кроме того, оказалось, что фукоидан, экстрагированный из бурой водоросли Ascophyllum nodosum , лишь незначительно влияет на ингибирование C1s C1-INH [31]. Росси и др. продемонстрировали, что усиление C1-INH олигомерами гепарина происходит из-за связывания как с C1-INH, так и с C1s [32]. Совсем недавно сравнивали эффекты НФГ и низкомолекулярных гепаринов (НМГ) на активацию ЦП, ЛП и АР в отсутствие и в присутствии C1-INH [33].

Исследования протеаз контактной системы, нацеленных на C1-INH, показали, что UFH, HS, DexS, дерматансульфат и LMWH усиливают ингибирование FXIa C1-INH, но не влияют на калликреин и даже защищают FXIIa от ингибирования C1-INH. [34–36].Напротив, Gozzo et al. обнаружили незначительное усиление ингибирования калликреина C1-INH в присутствии UFH, HS и CS [37].

Принимая во внимание эти ограниченные данные, мы исследовали более 40 SG на предмет их потенцирующего действия на ингибирование C1s с помощью C1-INH. Оценивая взаимосвязь структура-активность, мы стремились охарактеризовать структурные особенности SG, которые в основном подходят для использования в качестве усилителя C1-INH. Более того, были исследованы структурно-зависимые эффекты SG на FXIIa и его ингибирование с помощью C1-INH, поскольку эта ключевая сериновая протеаза контактной системы дополнительно запускает активацию CP-комплемента и участвует в патофизиологии HAE [38,11].

Помимо различных гепаринов и других гликозаминогликанов, в исследование были включены нативные и частично деполимеризованные SG, выделенные из четырех различных водорослей. Две серии полусинтетических структурно определенных β-1,3-глюканов сульфатов позволили нам более подробно изучить влияние молекулярной массы (M _r ) и степени сульфатирования (DS) независимо от основной структуры гликана.

Исследование показало, что потенцирующий эффект SG на ингибирование C1s с помощью C1-INH зависит от их степени сульфатирования (DS), их молекулярной массы (M _r ), а также их гликановой структуры, в результате чего влияние M _r тесно связан с DS SG.Напротив, SG не влиял на ингибирование FXIIa с помощью C1-INH, но структурно-зависимо либо стимулировал, либо напрямую ингибировал активность FXIIa.

Материалы и методы

Материалы

Ингибитор C1 из плазмы человека (C1-INH, GenWay Biotech, Сан-Диего, США) разбавляли фосфатным буфером (20 ммоль / л KH ₂ PO ₄ , 250 ммоль / л KCl, pH 7,0) до 5 Исходный раствор мг / мл, делят на аликвоты и хранят при -80 ° C. Набор для тестирования C1-INH Technochrom ^® (Technoclone, Вена, Австрия) предоставил C1s эстеразу, хромогенный субстрат для C1s (C ₂ H ₅ CO-Lys (ϵ-Cbo) -Gly-Arg-pNA) и готовые к использованию буферы (буфер ТРИС A: 50 ммоль / л, ТРИС, 257 ммоль / л NaCl, pH 7.4; Трис-буфер B: 50 ммоль / л TRIS, 257 ммоль / л NaCl, pH 8,3). В соответствии с описанием продуктов и лиофилизированный фермент, и субстрат восстанавливали с помощью Ampuwa ^® .

Человеческий α-фактор XIIa (FXIIa, Enzyme Research Laboratories, Саут-Бенд, США) разбавляли буфером ацетата натрия (4 ммоль / л ацетата натрия, 150 ммоль / л NaCl, pH 5,3) до исходного раствора 1 мг / мл. аликвоты и хранение при -80 ° C.

Хромогенный субстрат для FXIIa (S-2302 ^TM , HD-Pro-Phe-Arg-pNA • 2 HCl) был получен от Chromogenix (Instrumentation Laboratory, Bedford, USA) и разбавлен Ampuwa ^® до 4 ммоль. / л маточного раствора.

Тестируемые соединения

Структурные характеристики всех тестируемых соединений, включая их молекулярную массу (M _r ) и степень сульфатирования (DS), указаны в таблице 1. Все анионные гликаны использовали в форме натриевой соли, если не указано иное.

Heparins.

Было протестировано несколько гепаринов и модифицированных гепаринов: Помимо нефракционированного гепарина из слизистой оболочки кишечника свиней (НФГ, 200 МЕ / мг, Novartis, Нюрнберг, Германия), низкомолекулярные гепарины (НМГ) (1) надропарин (NADRO, GlaxoSmith , Мюнхен, Германия), (2) эноксапарин (ENOXA, BfArM, пробы №11-07 / 08 05.06.2008), (3) цертопарин (CERTO, Novartis, Нюрнберг, Германия) и (4) тинзапарин (TINZA, EDQM, Страсбург, Франция), а также N -ацетил- de- O -сульфатный гепарин (de O sUFH, Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США) de- N -сульфатный гепарин (de N sUFH, Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США) и гиперсульфатированный гепарин (OSHep, Neoparin, Аламеда, Калифорния, США). Гепарин средней молекулярной массы (MMWH), гепарин очень низкой молекулярной массы (VLMWH) и олигосахариды, в основном состоящие из пентасахаридных единиц (PENTA), были любезными подарками от Novartis.Фондапаринукс (FPX, Arixtra ^® ) был любезным пожертвованием от Glaxo Smith Kline (Нотр-Дам де Бондвиль, Франция).

Другие гликозаминогликаны.

В исследование был включен ряд как встречающихся в природе, так и химически модифицированных гликозаминогликанов (ГАГ): хондроитинсульфат А из трахеи крупного рогатого скота (CS-A, Sigma-Aldrich, Сент-Луис, штат Миссури, США), хондроитинсульфат В из свиного слизистая оболочка кишечника, синоним дерматансульфат (CS-B, Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США) и хондроитинсульфат C из акульего хряща (CS-C, Sigma-Aldrich, St.Луис, штат Миссури, США) были включены в исследование.

Сверхсульфатированный хондроитинсульфат (OSCS) был синтезирован сульфатированием хондроитин-4-сульфата (CS-A, как описано выше) согласно Maruyama et al. [39].

Два различных гепарансульфата были протестированы и сравнены с данапароидом: (1) гепарансульфат, выделенный из почек крупного рогатого скота (HS33-04, Sigma Aldrich, Сент-Луис, штат Миссури, США), (2) гепарансульфат, выделенный из слизистой оболочки кишечника свиней (HS11 -08, Идурон, Чешир, Великобритания).

Данапароид (DANA, EDQM, Страсбург, Франция) представляет собой сложную смесь сульфатированных ГАГ, полученных из слизистой оболочки кишечника свиней.Его основными составляющими являются гепарансульфат, дерматансульфат (8–16% (м / м)) и различные типы сульфатов хондроитина (до 8,5% (м / м)) [40].

Гиалуроновая кислота (HA, калиевая соль, Merck KGaA, Дармштадт, Германия) и фрагменты гиалуроновой кислоты со степенью полимеризации около 18 (oligoHA, Iduron, Chesire, UK) были выбраны в качестве несульфатированных ГАГ.

Декстран и сульфаты декстрана.

Мы протестировали низкомолекулярный декстран (Dex-L, SERVA Electrophoresis, Гейдельберг, Германия) и высокомолекулярный декстран (Dex-H, SERVA Electrophoresis, Гейдельберг, Германия), а также низкомолекулярный декстран. сульфат (DexS-L, Sigma-Aldrich, St.Луис, штат Миссури, США) и высокомолекулярный сульфат декстрана (DexS-H, SERVA Electrophoresis, Heidelberg, Германия).

β-1,3-глюкановые сульфаты.

Были изучены две серии полусинтетических β-1,3-глюкановых сульфатов, различающихся по M _r и DS. Обе серии были получены сульфатированием природных линейных β-1,3-глюканов с SO ₃ / пиридин в диметилформамиде: (1) курдлансульфаты (CurS) являются производными высокомолекулярного курдлана (Wako Pure Chemicals Industries, Осака). , Япония) [41], (2) фикаринсульфаты (PhyS) были синтезированы с использованием низкомолекулярного Phycarin ^® (Goëmar Laboratories, St.Мало, Франция) в качестве исходного материала [42,43].

Сульфатированные гликаны и альгинат натрия, полученные из водорослей.

Фукозосодержащие сульфатированные полисахариды из Saccharina latissima ( S . l .-SP) были экстрагированы из высушенного материала бурой водоросли Saccharina latissima L., как описано ранее, и идентифицированы как сульфатированный галактофукан с примерно 60% фукозы и 15% галактозы в качестве основных моносахаридов [44]. Мы исследовали две партии из северной части Атлантического океана, выловленные либо в мае ( S . л .-СП № 2) или в сентябре ( S . л . -СП № 1). Эти две партии в основном различаются по своему DS, поскольку среда обитания и время сбора урожая влияют на содержание сульфатов в S . л .-СП [44].

Кроме того, две партии коммерчески доступных фукозосодержащих сульфатированных полисахаридов из Fucus vesiculosus L., названных фукоиданом и содержащих около 82% фукозы, ( F . v .-SP # a / b, Sigma-Aldrich , Г.Луис, штат Миссури, США) были включены в исследование.

Сульфатированные полисахариды красных водорослей Delesseria sanguinea (Hudson, Lamouroux) ( D . s .-SP) и Coccotylus truncatus ( C . t .-SP) были выделены с использованием стандартизованного процедура и охарактеризована как гомогенные фракции разветвленных сульфатированных ксилогалактанов, с примерно 76% галактозы и 13% ксилозы в случае D . s .-SP и около 87% галактозы и 4% ксилозы в случае C . т .-СП [45].

Дополнительно мы включили серию S . л .-SP, F . v .-SP и C . т . — СП, подвергнутых частичной гидротермальной деполимеризации (табл. 2).

Альгинат натрия был использован в качестве представителя несульфатированных гликанов, полученных из водорослей (ALG, Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США).

Методы

Тестирование ингибирования C1s ингибитором C1 и влияние сульфатированных гликанов.

Эффект C1-INH на активность C1s-эстеразы в присутствии и в отсутствие тестируемых соединений измеряли с помощью анализа хромогенного субстрата, проводимого в микропланшетах (nunc ™ 269620, Thermo Fisher Scientific, Langenselbold, Германия).

Исходный раствор C1-INH разбавляли трис-буфером A (50 ммоль / л TRIS, 257 ммоль / л NaCl, pH 7,4) до рабочей концентрации 15 мкг / мл (143 нмоль / л). C1s-эстеразу разбавляли 1: 4 трис-буфером А и хранили на льду до использования. Хромогенный субстрат разбавляли 1: 6 трис-буфером B (50 ммоль / л TRIS, 257 ммоль / л NaCl, pH 8.3). Исследуемые соединения разбавляли до рабочей концентрации 50 мкг / мл солевым буфером веронала (VBS, 4,94 ммоль / л, 5,5-диэтилбарбитуровая кислота, 145 ммоль / л NaCl, 0,83 ммоль / л хлорида магния, 0,25 ммоль / л кальция. дигидрат хлорида, pH 7,3). Кроме того, в VBS готовили серии разведений следующих соединений: UFH, PS3, OSHep: 0,1, 1,0, 10,0, 50,0, 100,0 мкг / мл; Серии CurS и PhyS: 2,5, 5,0, 10,0, 50,0 мкг / мл.

Первоначально в микропланшет загружали 20 мкл раствора образца на лунку и инкубировали при 37 ° C в течение 10 мин.Затем добавляли по 20 мкл каждого, C1s и C1-INH. После инкубации при 37 ° C и встряхивании в течение 5 минут в каждую лунку пипеткой вносили 100 мкл предварительно нагретого хромогенного субстрата (конечная концентрация: 0,625 ммоль / л). Планшет дополнительно инкубировали при 37 ° C при встряхивании в течение 15 мин. Реакцию останавливали добавлением 40 мкл 50% уксусной кислоты на лунку. Поглощение измеряли при 405 нм относительно холостого опыта. Контрольными значениями были (1) VBS вместо тестируемого соединения и трис-буфер A вместо C1-INH (100% активность C1s), (2) VBS вместо тестируемого соединения (100% активность C1-INH) и (3) VBS вместо тестируемое соединение, трис-буфер A вместо C1-INH и C1s (пустой).Все образцы и контроли тестового прогона тестировались в двух экземплярах на каждом микропланшете, и каждый тестовый прогон повторялся не менее трех раз в разные дни.

Исследование прямого влияния сульфатированных гликанов на активность C1s.

В соответствии с описанной выше процедурой проверяли прямое влияние всех тестируемых соединений на активность C1s. Для этого C1-INH заменяли 20 мкл TRIS-буфера A. Все образцы тестировали в двух экземплярах на микропланшет, по крайней мере, в три разных дня.

Тестирование ингибирования FXIIa ингибитором C1 и влияние сульфатированных гликанов.

Влияние C1-INH на активность FXIIa в присутствии и в отсутствие UFH, PS3, CurS3 и S . -1 .-SP # 1 измеряли с помощью анализа хромогенного субстрата, проводимого в микропланшетах (nunc ™ 269620, Thermo Fisher Scientific, Langenselbold, Германия).

Исходный раствор C1-INH разбавляли буфером TRIS (50 ммоль / л TRIS, 113 ммоль / л NaCl, pH 7,8) до рабочей концентрации 20 мкг / мл (191 нмоль / л).FXIIa разбавляли буфером TRIS до рабочей концентрации 30 мкг / мл (375 нмоль / л) и хранили на льду до использования. Исследуемые соединения разбавляли до рабочей концентрации верональным буферным солевым раствором (VBS, 4,94 ммоль / л, 5,5-диэтилбарбитуровая кислота, 145 ммоль / л NaCl, 0,83 ммоль / л хлорида магния, 0,25 ммоль / л дигидрата хлорида кальция, pH 7,3. ).

Первоначально в микропланшет загружали 20 мкл раствора образца на лунку и инкубировали при 37 ° C в течение 10 мин. Затем добавляли по 20 мкл каждого FXIIa и C1-INH.После инкубации при 37 ° C при встряхивании в течение 10 мин в каждую лунку пипеткой вносили 100 мкл S-2302 1 ммоль / л в буфере TRIS (50 ммоль / л TRIS, pH 7,8). Кинетику поглощения при 405 нм измеряли при 37 ° C в течение 30 минут, при этом точки данных через 10 минут служили значениями для сравнения тестируемых соединений. Контрольные значения были (1) VBS вместо тестируемого соединения и буфера TRIS вместо C1-INH (100% активность FXIIa), (2) VBS вместо тестируемого соединения (100% активность C1-INH) и (3) VBS вместо теста соединение, буфер TRIS вместо C1-INH и FXIIa (пустой).Все образцы тестировали в двух экземплярах на микропланшет.

Тестирование прямого влияния сульфатированных гликанов на активность FXIIa.

В соответствии с процедурой, описанной выше, исследовали прямое влияние тестируемых соединений на активность FXIIa. Для этого C1-INH был заменен 20 мкл буфера TRIS. Все образцы тестировали в двух экземплярах на микропланшет, по крайней мере, в два разных дня.

Анализ данных.

Линейные и нелинейные регрессии и статистика были рассчитаны с помощью SigmaPlot ^TM 11.0 (Systat Software Inc.). Значения P ≤ 0,05 считались значимыми и рассчитывались с помощью одностороннего дисперсионного анализа с последующими множественными сравнениями с контролем (метод Холма-Сидака), если не указано иное.

Результаты

Оценка времени инкубации в анализе C1-INH / C1s

В ходе разработки анализа C1-INH / C1s исследовали влияние различных процедур инкубации, при этом PS3 использовали в качестве примерного усилителя C1-INH. Цели заключались в следующем: (1) определить степень и скорость ингибирования C1s с помощью C1-INH, (2) оценить степень потенцирования C1-INH PS3 и (3) оценить влияние преинкубации PS3 с C1- Только INH, а также инкубация с C1-INH и C1s на его усиливающий эффект C1-INH.

Влияние предварительной инкубации тестируемого соединения и ингибитора C1 на ингибирование C1s.

После предварительной инкубации C1-INH в отсутствие и в присутствии PS3 (конечная концентрация: 0,625 мкг / мл) в течение 0, 2, 5, 10 или 15 минут при 37 ° C определяли остаточную активность C1s, как описано в материалах и методы. Ингибирование C1s рассчитывали относительно 100% активности C1s без C1-INH и PS3.

C1-INH ингибировал амидолитическую активность C1s на 31 ± 1%. PS3 (конечная концентрация: 0.625 мкг / мл) увеличивало это ингибирование C1s примерно на 90 ± 10%. Предварительная инкубация PS3 и C1-INH не приводила к усилению ингибирования C1s. Поэтому анализ впоследствии проводили без предварительной инкубации C1-INH с тестируемым соединением.

Влияние времени инкубации тестируемого соединения с ингибитором C1 и C1s на ингибирование C1s.

Чтобы оценить скорость ингибирования C1s с помощью C1-INH и степень потенцирования C1-INH SG в зависимости от времени реакции C1-INH-C1s, мы определили ингибирование C1s после инкубации C1-INH с C1s в отсутствие и наличие PS3 в течение 0, 2, 5, 10, 15 и 30 мин.Ингибирование амидолитической активности C1s с помощью C1-INH оказалось медленным процессом (рис. 1). Через 30 мин она составила 88 ± 6% при 50% ингибировании фермента через 4 мин. В присутствии PS3 (конечная концентрация: 1,25 мкг / мл) примерно 90% ингибирование C1s было достигнуто уже после инкубации в течение 5 минут (рис. 1). По-видимому, реакция между C1-INH и C1s ускорялась в присутствии PS3 с 50% ингибированием фермента уже через 1 мин. Однако расчетное усиление C1-INH, связанное с ингибированием C1s одним C1-INH, уменьшалось с увеличением времени инкубации.Через 2 минуты PS3 увеличил ингибирование C1s с 35 ± 3% до 71 ± 3%, что соответствует усилению примерно на 100%, тогда как через 15 минут оно составило 15 ± 7%. Хотя потенцирование через 2 мин было еще сильнее, следующие эксперименты были выполнены с временем инкубации 5 мин по практическим соображениям. Следует отметить, что увеличение ингибирования C1s с 55 ± 6% до 87 ± 3% под действием PS3 через 5 мин соответствовало усилению на 65%, что было почти максимально возможным.

Рис. 1. Ингибирование C1s ингибитором C1 зависит от времени инкубации и ускоряется в присутствии PS3.

C1s инкубировали с C1-INH в отсутствие и в присутствии PS3 (конечная концентрация: 1,25 мкг / мл) в течение 0–30 мин при 37 ° C. Затем определяли остаточную активность C1s с помощью анализа хромогенного субстрата. Ингибирование C1s (%) рассчитывали по отношению к активности C1s в отсутствие C1-INH и PS3. Усиление C1-INH (%) представляет собой увеличение ингибирования C1s PS3 по сравнению с ингибированием C1s одним C1-INH.Среднее значение ± стандартное отклонение (n ≥ 3 тестов в разные дни).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0165493.g001

Ингибирование C1s ингибитором C1 и его усиление сульфатированными гликанами

Перед исследованием структурно-зависимого потенцирования C1-INH с помощью SG мы проверили, оказывает ли какое-либо из тестируемых соединений прямое влияние на активность C1s. Поскольку ни один из тестируемых SG не ингибировал C1s напрямую (S1 фиг.), Усиленное ингибирование C1s в присутствии C1-INH было связано исключительно с их потенцирующим действием на C1-INH (фиг. 2).

Рис. 2. Сульфатированные гликаны усиливают ингибирование C1s ингибитором C1.

Активность C1s измеряли в отсутствие и в присутствии C1-INH и тестируемых соединений (конечная концентрация указана) с помощью анализа хромогенного субстрата. а) Остаточная активность C1s после инкубации с C1-INH в отсутствие и в присутствии нефракционированного гепарина (UFH), гиперсульфатированного гепарина (OSHep) и β-1,3-глюкана сульфата PS3. Серой пунктирной линией отмечена активность C1s в присутствии только C1-INH.б) Усиление C1-INH (%), рассчитанное как отношение дополнительного ингибирования C1s в присутствии тестируемого соединения к ингибированию C1s одним только C1-INH. Среднее ± стандартное отклонение (n = 3 теста в разные дни).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0165493.g002

В качестве примера на рис. 2 представлено снижение активности C1s в зависимости от концентрации тремя SG UFH, OSHep и PS3 (рис. 2A) и их соответствующее потенцирование C1-INH (рис. 2B). PS3 превосходил OSHep и UFH; 1.25 мкг / мл PS3 приводило к усилению C1-INH примерно на 65%, что было максимально возможным в используемых экспериментальных условиях. Чтобы оценить усиление C1-INH SG в зависимости от их структурных характеристик, их эффекты в первую очередь сравнивали в конечной концентрации 6,25 мкг / мл.

Heparins.

Тестирование серии гепаринов, различающихся по их M _r , показало, что их потенцирующий эффект C1-INH зависит от их M _r (S2 Рис). Наименьшее соединение (PENTA, M _r 1 500) было полностью неактивным, тогда как UFH был самым активным соединением среди гепаринов с аналогичной DS.Но DS тоже сыграл свою роль (рис. 3). Несмотря на их высокий M _r , два десульфатированных гепарина de N sUFH и de O sUFH были неактивными, тогда как высокосульфатированный пентасахарид фондапаринукс (FPX) демонстрировал, по крайней мере, небольшое усиление C1-INH (3,3 ± 5,3% при конечная концентрация 6,25 мкг / мл). OSHep привел к еще более сильному усилению C1-INH, чем UFH: около 66% против 55% при конечной концентрации 6,25 мкг / мл (рис. 2, рис. 3).

Рис. 3. Усиление активности ингибитора C1 гепаринами зависит как от их молекулярной массы, так и от степени сульфатирования.

Активность C1s измеряли в присутствии C1-INH и различных гепаринов (конечная концентрация: 6,25 мкг / мл) с помощью анализа хромогенного субстрата. Усиление C1-INH (%) представляет собой увеличение ингибирования C1s в присутствии тестируемого соединения по сравнению с ингибированием C1s одним C1-INH. Среднее значение ≥ 3 тестов в разные дни.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0165493.g003

Другие гликозаминогликаны.

Среди протестированных сульфатированных ГАГ CS-A, CS-B, CS-C и HS33-04, все они имеют DS ≤ 0.4, бездействовали. Напротив, мы обнаружили умеренную потенцирующую активность C1-INH для более высокосульфатированного гепарансульфата HS11-08 (DS 0,8), а также для данапароида, который также состоит в основном из гепарансульфата. Данапароид имеет среднюю DS около 0,5, но дополнительно содержит около 4% высокосульфатированного антитромбинсвязывающего гепарансульфата [46]. При сравнении трех видов гепарансульфата (HS33-04, HS11-08 и данапароид) и гепарина (например, TINZA), который можно рассматривать как более высокосульфатированный гепарансульфат, DS оказался решающим параметром для их потенцирования C1-INH. активность (рис. 4А).Его важная роль также становится очевидной с OSCS, который был очень активен, тогда как низкосульфатированные CS-A, -B и -C скорее ослабляли ингибирование C1s с помощью C1-INH (рис. 4B). Интересно, что гиалуроновая кислота (HA, M _r 0), которая заряжена отрицательно из-за уроновых кислот, но не сульфатных групп, а также фрагменты HA (oligoHA M _r 3600) слегка потенцируют C1-INH. примерно на 8 ± 2% при конечной концентрации 6,25 мкг / мл.

Рис. 4. Усиление ингибитора C1 другими гликозаминогликанами подтверждает важность степени сульфатирования.

Активность C1s измеряли в присутствии C1-INH и тестируемых соединений (конечная концентрация: 6,25 мкг / мл) с помощью анализа хромогенного субстрата. Усиление C1-INH (%) представляет собой увеличение ингибирования C1s в присутствии тестируемого соединения по сравнению с ингибированием C1s одним C1-INH. a) Усиление C1-INH видами гепарансульфата, включая НМГ тинзапарин, в зависимости от их DS и M _r . б) Усиление C1-INH сульфатами хондроитина в зависимости от их DS и M _r .Среднее значение ± стандартное отклонение (n ≥ 3 тестов в разные дни).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0165493.g004

Декстран и сульфаты декстрана.

Чтобы подтвердить важность сульфатных групп для усиления C1-INH, мы протестировали два декстрана (Dex) и два высокосульфатированных сульфата декстрана (DexS) с разными M _r . В то время как несульфатированные соединения были неактивными, оба DexS проявляли сильный усиливающий эффект C1-INH (рис. 5). DexS-H был более активен, чем DexS-L, что позволяет предположить, что большая разница в их M _r превышает важность DS.

Рис. 5. Декстрансульфаты усиливают ингибирование C1s ингибитором C1, тогда как несульфатированные декстраны неактивны.

Активность C1s измеряли в присутствии C1-INH и декстрансульфатов (DexS) или декстранов (Dex) (конечная концентрация, как указано) с помощью анализа хромогенного субстрата. Усиление C1-INH (%) представляет собой увеличение ингибирования C1s в присутствии тестируемого соединения по сравнению с ингибированием C1s одним C1-INH. Среднее значение ± стандартное отклонение (n ≥ 3 тестов в разные дни).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0165493.g005

β-1,3-глюкановые сульфаты.

Для более подробной оценки M _r и DS-зависимости потенцирующей активности C1-INH SG мы протестировали две серии полусинтетических β-1,3-глюкановых сульфатов с различными DS, а именно низкомолекулярный фикарин. сульфаты (PhyS) и высокомолекулярные сульфаты курдлана (CurS).

Эти SG усиливали эффект C1-INH против C1 в основном DS-зависимо, в результате чего эффект увеличивался только до DS, равного 1.8, а затем достигли своего рода плато (рис. 6А). Влияние M _r было особенно заметно в случае SG с относительно низким DS: PhyS1 с самым низким DS 0,75 был неактивным, тогда как более крупный CurS1 с еще более низким DS 0,64 демонстрировал зависящее от концентрации усиление C1-INH ( Рис 6B). В отличие от сопоставимых активностей при той же гравиметрической концентрации, тестирование примерно одинаковых молярных концентраций выявило значительное увеличение активности также между более сульфатированными PhyS3 и CurS3a, но не между CurS3a (M _r 70000) и CurS3 (M _r ). 160 000).

Рис. 6. Усиление действия ингибитора C1 β-1,3-глюкановыми сульфатами зависит как от степени сульфатирования, так и от молекулярной массы.

Активность C1s измеряли в присутствии C1-INH и тестируемого соединения (конечная концентрация: a) 0,625 мкг / мл b) 0,3125–0,625–1,25–6,25 мкг / мл) с помощью анализа хромогенного субстрата. Усиление C1-INH (%) представляет собой увеличение ингибирования C1s в присутствии тестируемого соединения по сравнению с ингибированием C1s одним C1-INH (CurS = сульфаты курдлана; PhyS = сульфаты фикарина).Среднее ± стандартное отклонение (n = 4 теста в разные дни).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0165493.g006

Сульфатированные полисахариды, полученные из водорослей, и альгинат натрия.

В качестве дополнительных примеров SG, имеющих гликановую структуру, полностью отличную от GAG и гомоглюканов, мы исследовали несколько сульфатированных гликанов, выделенных из двух красных водорослей и двух видов бурых водорослей: (1) сульфатированный ксилогалактан из Delesseria sanguinea ( D , ). с .-SP), (2) сульфатированный ксилогалактан из Coccotylus truncatus (C . t .-SP), две партии каждой из фукозосодержащих сульфатированных полисахаридов из (3) Saccharina latissima L. ( S l .-SP) и (4) Fucus vesiculosus L. ( F . v .-SP). Упомянутые SG, полученные из водорослей, представляют собой разветвленные гетерогликаны с DS не более 0,71 и M _r в диапазоне от 27 000 до 541 000. Все эти SG усиливают эффект C1-INH против C1s с высокомолекулярной массой S . л . Партии — SP (M _r > 500 000) значительно превосходят другие SG, полученные из водорослей (рис. 7). Сравнение S . л .-SP, F . Парные партии v .-SP и ксилогалактан между собой снова выявили зависимость от DS. Несульфатированный альгинат натрия, состоящий исключительно из уроновых кислот, был неактивен.

Рис. 7. Усиление ингибитора C1 сульфатированными гликанами из водорослей.

Активность C1s измеряли в присутствии C1-INH и SG из водорослей из Saccharina latissima ( S . l .-SP), Fucus vesiculosus ( F . v .-SP), Delesseria sanguinea ( D . s .-SP) и Coccotylus truncatus ( C . t .-SP) (конечная концентрация: 6,25 мкг / мл) с помощью анализа хромогенного субстрата. Усиление C1-INH (%) представляет собой увеличение ингибирования C1s в присутствии тестируемого соединения по сравнению с ингибированием C1s одним C1-INH. Разные буквы указывают на статистически значимые различия ( P ≤ 0.05). Среднее значение ± стандартное отклонение (n ≥ 3 тестов в разные дни).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0165493.g007

Учитывая наблюдаемую неактивность GAG с DS ≤ 0,42 и обнаруженную компенсацию низкого DS высоким M _r в случае CurS, мы хотел проверить, есть ли предельно высокий M _r от S . l .-SP # 2 (DS 0.35) имеет решающее значение благодаря своей ярко выраженной активности. Для этого его M _r постепенно восстанавливали гидротермальной деполимеризацией до M _r 77 000 (Таблица 2).Однако усиливающий эффект C1-INH этих образцов в конечной концентрации 6,25 мкг / мл снизился только при M _r ≤ 151 000, а эффект образца с M _r 77000 снизился на 22% (Таблица 2) еще выше, чем у сульфатированных ксилогалактанов. Аналогично, активность постепенно деполимеризованных образцов некоторых высших сульфатированных F . v .-SP # b (M _r 38 000, DS 0,63) уменьшилось только при M _r ≤ 15 900 и уменьшилось примерно на 60% при M _r 10 300 (Таблица 2). С . t .-SP (M _r 128 000) и деполимеризованный образец (M _r 73 000) с промежуточной DS 0,47 лишь незначительно различались по их потенцирующей активности C1-INH (таблица 2).

В отличие от сравнения, основанного на гравиметрических концентрациях, которое может недооценивать роль M _r , эксперименты с примерно равными молярными концентрациями привели к более сильной зависимости M _r с двухфазными кривыми для обоих S . л .-SP и F . v .-SP. Тогда как деятельность S . Образцы l .-SP с M _r 541 000 и M _r 325 000 существенно не различались, наблюдалось линейное снижение активности при M _r ≤ 218 000. Активности F . v .-SP линейно уменьшались в диапазоне M _r от 38 000 до 15 900; только снижение активности между образцами 15 900 и 10 300 было более выраженным (рис. 8).Что подтверждается прямым сравнением S . л .-SP и F . v .-SP (100 нмоль / л), наблюдалось линейное снижение активности в диапазоне M _r между 218 000 и 15 900).

Рис. 8. Усиление действия ингибитора C1 фукозосодержащими сульфатированными гликанами из бурых водорослей зависит от молекулярной массы.

Активность C1s измеряли в присутствии C1-INH и тестируемого соединения с помощью анализа хромогенного субстрата. Усиление C1-INH представляет собой увеличение ингибирования C1s в присутствии тестируемого соединения по сравнению с ингибированием C1s одним C1-INH.а) S . l .-SP # 2 (DS 0,35) в конечной концентрации 25 нмоль / л и б) F . v . — SP # b (DS 0,63) в конечной концентрации 500 нмоль / л испытывали после деполимеризации, в результате чего получали M _r , как указано на оси абсцисс. Среднее ± стандартное отклонение (n = 4 теста в разные дни).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0165493.g008

Тестирование C . t .-SP образцов в концентрации 50 нмоль / л, потенцирование C1-INH недеградированным (M _r 128 000) и деградированным образцом (M _r 73 000) составило 12.3 ± 2,8% и 9,2 ± 2,0% соответственно. Сравнение этих действий с S . l .-SP образцы с эквивалентным M _r ( S . l .-SP # 2 _90min , S . l .-SP # 2 _160min ), даже 25 нмоль / л фукозы S . l .-SP были выше.

Ингибирование FXIIa ингибитором C1 и модуляция активности сульфатированными гликанами

C1-INH является не только основным ингибитором связанных с комплементом C1s, но также нейтрализует FXIIa, FXIa и калликреин контактной системы.Поскольку FXIIa дополнительно активирует классический путь системы комплемента, превращая C1r в его активную форму [38], особый интерес представляло проверить, усиливают ли сульфатированные гликаны ингибирование FXIIa с помощью C1-INH.

Для сравнения потенциальной активности SG в отношении ингибирования FXIIa с помощью C1-INH с активностями по ингибированию C1s использовали аналогичный хромогенный анализ. В соответствии с кинетическими данными, описанными в литературе [28,34], реакция между FXIIa и C1-INH оказалась медленнее, чем взаимодействие C1s / C1-INH с 23 мин по сравнению с4 мин необходимо для 50% ингибирования фермента (S3 фиг. И фиг. 1). Следовательно, 5-минутное время инкубации в анализе C1s / C1-INH было увеличено до 10 минут, что привело к ингибированию FXIIa примерно на 30–35% с помощью C1-INH (S3 фиг. И фиг. 9).

Рис. 9. Ингибирование FXIIa сульфатированными гликанами в отсутствие и в присутствии ингибитора C1.

FXIIa инкубировали с различными сульфатированными гликанами (конечная концентрация указана) в отсутствие и в присутствии C1-INH в течение 10 мин при 37 ° C. После добавления S-2302 и дальнейшей инкубации в течение 10 минут при 37 ° C измеряли оптическую плотность при 405 нм.Темной пунктирной линией отмечен 100% контроль в отсутствие как C1-INH, так и тестируемого соединения. Серой пунктирной линией отмечена активность FXIIa в присутствии только C1-INH. а) UFH, нефракционированный гепарин, б) S . l .-SP # 1, сульфатированный гликан, выделенный из бурой водоросли Saccharina latissima , c) PS3, низкомолекулярный β-1,3-глюкановый сульфат, d) CurS3, высокомолекулярный β-1, Сульфат 3-глюкана. Среднее ± стандартное отклонение (n ≥ 2).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0165493.g009

Первоначальные эксперименты, проведенные с некоторыми SG, различающимися по структуре гликанов, а именно UFH, S . l .-SP # 1, PS3 и CurS3, выявили расходящиеся эффекты (рис. 9). Два β-1,3-глюкановых сульфата PS3 и CurS3 улучшили ингибирование FXIIa с помощью C1-INH, достигнув усиления C1-INH примерно на 124% на 12,5 мкг / мл PS3 и примерно на 107% на 12,5 мкг / мл CurS3, тогда как UFH скорее имел тенденцию ослаблять ингибирование FXIIa C1-INH. S . л .-SP приводил к еще более выраженному ослаблению ингибирования FXIIa, в результате чего средняя концентрация 1,25 мкг / мл полностью устраняла эффект C1-INH.

Исследование SG в отсутствие C1-INH привело к аналогичным прямым эффектам на FXIIa (рис. 9). Принимая во внимание, что UFH только незначительно улучшил активность FXIIa, S . l .-SP демонстрирует колоколообразную кривую со значительным увеличением активности FXIIa при концентрации 1,25 мкг / мл. Напротив, оба β-1,3-глюкановых сульфата (PS3 и CurS3) — помимо незначительного увеличения активности при 0.125 мкг / мл в зависимости от концентрации снижали активность FXIIa до 56% и 52% соответственно (рис. 9C и 9D). Чтобы прояснить эти расходящиеся находки, мы стремились исследовать структурно-зависимые эффекты SG на активность FXIIa более подробно.

β-1,3-глюкановые сульфаты.

Высокомолекулярные сульфаты курдлана показали противоположные эффекты на активность FXIIa в зависимости от их DS. Низкосульфатированные соединения CurS1 (DS 0,64) и CurS2 (DS 1,34) улучшали активность FXIIa, как и S . l .-SP, при этом достаточно низкая концентрация 1,25 мкг / мл CurS1 вызвала наиболее сильное увеличение — на 25%. В отличие от этого, более высокосульфатированные CurS3 (DS 1,74) и CurS3a (DS 1,78) приводили к снижению активности FXIIa в зависимости от концентрации (фиг. 10A).

Рис. 10. Активность FXIIa в присутствии сульфатов β-1,3-глюкана.

FXIIa инкубировали с а) сульфатами курдлана (CurS) или б) сульфатами фикарина (PhyS) в течение 10 мин при 37 ° C. Затем его амидолитическую активность измеряли с помощью S-2302.Пунктирной линией отмечен положительный контроль в отсутствие тестируемого соединения. Звездочки указывают на статистически значимые различия (P≤0,05) по сравнению с положительным контролем. Среднее ± стандартное отклонение (n ≥ 2 тестов в разные дни).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0165493.g010

Аналогичная DS-зависимая модуляция наблюдалась с низкомолекулярными сульфатами фикарина. PhyS с самым низким DS 0,75 усиливал активность FXIIa — в отличие от CurS1 и CurS2 — зависимо от концентрации, тогда как PhyS2 (DS 1.48) почти не повлияли. Три PhyS с DS ≥ 1,80 приводили к зависимому от концентрации снижению активности FXIIa (фиг. 10B).

Гликозаминогликаны.

Как и UFH, как низкомолекулярный гепарин TINZA, так и низкосульфатированный хондроитинсульфат CS-A (DS 0,30) имели тенденцию увеличивать активность FXIIa, хотя и незначительно. Однако гепарансульфат HS11-08 (DS 0,80) в зависимости от концентрации увеличивал активность FXIIa до 141% при 12,5 мкг / мл.

И наоборот, высшие сульфатированные ГАГ OSHep (DS 1.75) и OSCS (DS 2.00) в зависимости от концентрации снижали активность FXIIa примерно до 60% как при 6,25, так и при 12,5 мкг / мл. На фиг.11 в качестве примера представлены активности FXIIa, полученные в результате инкубации с 12,5 мкг / мл ГАГ.

Рис. 11. Активность FXIIa в присутствии гликозаминогликанов.

FXIIa инкубировали с нефракционированным гепарином (UFH), тинзапарином (TINZA), хондроитинсульфатом A (CS-A), гепарансульфатом (HS11-08), гиперсульфатированным гепарансульфатом (OSHep) и сверхсульфатированным хондроитинсульфатом (OSCS) ( конечная концентрация: 12.5 мкг / мл) в течение 10 мин при 37 ° C. Затем его амидолитическую активность измеряли с помощью S-2302. Пунктирной линией отмечен положительный контроль в отсутствие тестируемого соединения. Звездочки указывают на статистически значимые различия (P <0,05), рассчитанные с помощью t-критерия, по сравнению с положительным контролем. Среднее ± стандартное отклонение (n ≥ 2 тестовых прогонов в разные дни)

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0165493.g011

Декстрансульфаты.

Также два высокосульфатированных сульфата декстрана ингибировали активность FXIIa в зависимости от концентрации, в результате чего высокомолекулярный DexS-H превосходил низкомолекулярный DexS-L, несмотря на его несколько более низкую DS (1.54 по сравнению с 2,02) (рис. 12). Максимальное ингибирование снова было достигнуто при 6,25 мкг / мл.

Рис. 12. Активность FXIIa снижалась в присутствии сульфата декстрана.

FXIIa инкубировали с двумя декстрансульфатами, различающимися по молекулярной массе (DexS-L и DexS-H), в течение 10 мин при 37 ° C. Затем его амидолитическую активность измеряли с помощью S-2302. Пунктирной линией отмечен положительный контроль в отсутствие тестируемого соединения. Звездочки указывают на статистически значимые различия (P≤0,01) по сравнению с положительным контролем.Среднее ± стандартное отклонение (n ≥ 2 тестов в разные дни).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0165493.g012

Обсуждение

Физиологическое значение C1-INH, основного регулятора комплемента и контактной системы [2], доказано наследственным и приобретенным C1-INH-зависимым ангионевротическим отеком, который лечится плазменным или рекомбинантным C1-INH [2]. 11]. Более того, C1-INH проявляет терапевтический эффект при других заболеваниях и клинических ситуациях [25,24] и может иметь терапевтический потенциал при многих заболеваниях, где одновременно активируются тесно сшитый комплемент и контактная система [2].Благодаря своему потенцирующему эффекту C1-INH сульфатированные гликаны могут предлагать возможность улучшить либо эффективность терапевтически применяемого C1-INH, либо активность эндогенного C1-INH. В качестве элементарного шага были исследованы серии SG на предмет их модулирующего действия по C1-INH, чтобы получить больше информации о структурных характеристиках гликанов, полезных для этой цели. Кроме того, мы исследовали влияние на вторую иллюстративную сериновую протеазу, нацеленную на C1-INH [47, 48], чтобы оценить потенциальные различия, касающиеся взаимодействий SG с различными ферментами.Мы выбрали FXIIa, центральный фермент контактной системы, который дополнительно участвует в активации комплемента [2].

Нижеследующее обсуждение концентрируется на подробном анализе обнаруженных структурно-зависимых активностей для выяснения соответствующей роли M _r , DS и структуры гликана для исследованных активностей SG.

C1s, ингибитор C1 и сульфатированные гликаны

Кинетика реакции между C1s и ингибитором C1.

Чтобы сосредоточить внимание на структурно-зависимых эффектах SG на C1-INH и его протеазы-мишени, мы использовали анализ очищенного хромогенного субстрата.В этом эксперименте ингибирование C1s с помощью C1-INH было тем сильнее, чем дольше два реагента инкубировали вместе перед добавлением субстрата C1s (рис. 1). SG, такие как β-1,3-глюкановый сульфат PS3, не оказывал прямого ингибирующего действия на C1s, но сокращал время 50% ингибирования C1s (1,0 мин против 4,2 мин) без значительного увеличения максимального ингибирования C1s. Следовательно, потенцирование C1-INH за счет SG фактически означает ускорение этой реакции. Этот механизм соответствует хорошо известному антикоагулянтному механизму действия гепаринов, которые катализируют ингибирование фактора Ха и тромбина антитромбином.Однако, в то время как гепарин вызывает конформационные изменения антитромбина (т.е. аллостерию) и дополнительно действует как матрица, связывая как антитромбин, так и тромбин (т.е. соединяя мостик), Beinrohr et al. [49] предложили так называемый сэндвич-механизм для потенцирования C1-INH полианионами с сайтом связывания гепарина в области контакта встречного комплекса серпин-протеаза. Эксперименты Мюррея-Раста и др. [50] подтвердили, что взаимодействия полианионов как с C1-INH, так и с C1s играют жизненно важную роль в механизме ускорения реакции между C1s и C1-INH, и Rossi et al.[32] и Rajabi et al. [51] доказали связывание гепарина с C1-INH, а также с C1s посредством поверхностного плазмонного резонанса.

Усиление ингибитора C1 в зависимости от молекулярной массы.

Гепарин был первым описанным соединением, усиливающим C1-INH [26,52]. Между тем, помимо НФГ, для терапии и профилактики венозной тромбоэмболии широко используется ряд НМГ. Различные LMWH имеют разные профили M _r [53], но до сих пор не было известно, влияет ли это их потенцирующее действие на реакцию C1-INH-C1s.Тестирование четырех НМГ и еще четырех гепаринов, представляющих диапазон M _r от примерно 1 500 до 35 000, показало, что усиление C1-INH гепаринами улучшается с увеличением M _r и что LMWH только вдвое менее активны, чем UFH, при приблизительная оценка (S2 рис.). Однако, исходя из международных единиц (МЕ / мл) (НМГ: ~ 100 МЕ / мг, НМГ: ~ 200 МЕ / мг), потенцирующая активность НМГ аналогична таковой у НФГ и при терапевтических концентрациях в плазме (НМГ: ~ 1,0 МЕ / мл; НФГ: ~ 0,7 МЕ / мл), НМГ могут даже превосходить НФГ.Исключением является MMWH (M _r 10 500), который показал только потенциацию, аналогичную TINZA (M _r 6 500) при равных гравиметрических концентрациях. Это можно объяснить их перекрытием профилей M _r : в то время как MMWH содержит 30% (м / м) цепей с M _r <8000, массовый процент (м / м) TINZA с M _r > 8 000 составляет 22–36%. Более того, заметно более низкая активность MMWH по сравнению с UFH (M _r 15 000) вполне вероятна, учитывая, что UFH состоит из цепей с M _r до 35 000, тогда как MMWH содержит только 2.5% цепей с M _r 12 000-15 000. В отличие от активности олигосахаридов гепарина VLMWH (18,2 ± 2,7% потенцирования C1-INH при 6,25 мкг / мл), что соответствовало результатам Росси и другие. [32], неактивность олигосахаридов PENTA (-0,7 ± 2,8% потенцирования C1-INH при 6,25 мкг / мл) предполагает требование минимальной длины цепи или минимального количества сульфатных групп, соответственно. Последний вывод сделан на основании небольшого потенцирующего действия C1-INH (3,3 ± 5,3% при 6.25 мкг / мл) фондапаринукса (FPX), синтетического антитромбин-связывающего пентасахарида с 8 (DS 1.60) вместо примерно 5 сульфатных групп, что указывает на дополнительную значимость DS для потенцирования C1-INH. Поскольку пентасахариды слишком короткие, чтобы действовать как матрица между серпинами и протеазами, например антитромбина и тромбина, небольшая активность FPX поддерживает теорию сэндвичей Beinrohr et al. [49], но обнаруженная зависимость M _r ставит под сомнение их предположение о том, что длина цепи может иметь второстепенное значение.

Аналогичным образом, уже результаты Wuillemin et al. [28] предполагают, что по крайней мере сильно различающиеся M _r влияют на потенцирующую активность C1-INH SG, поскольку они обнаружили, что высокомолекулярный декстрансульфат (M _r 500 000, DS 1.9) был значительно более активен, чем малый сульфат декстрана (M _r 5000, DS не указан). Это подтверждается нашими данными с сульфатами декстрана: несмотря на более низкую DS, DexS-H (M _r 500 000, DS 1,54) все же был немного более активен, чем DexS-L (M _r 5 000, DS 2.02) (рис.5). На уровне молярных концентраций DexS-H был даже более чем на два порядка более активным, чем DexS-L.

Тесно связанная зависимость потенцирующей активности C1-INH SG как от M _r , так и от DS становится очевидной с двумя сериями β-1,3-глюкановых сульфатов, а именно CurS (DS 0,64–1,78) и PhyS (DS 0,75–3,00). PhyS имеют степень полимеризации около 25 (23–27) и, следовательно, длину цепи между LWMH и MMWH, тогда как CurS представляют диапазон M _r от 70 000–210 000.

В случае низкого DS (<0,8) высокое значение M _r оказалось решающим для потенцирующего эффекта C1-INH (активный CurS1 (DS 0,64, M _r 210 000) по сравнению с неактивным PhyS1 (DS 0,75, M _r 6000)) (Рис. 6B). Напротив, активность SG с DS ≥ 1,34, то есть выше, чем у гепаринов, не зависела от M _r (CurS2 против PhyS2; CurS3 против CurS3a против PhyS3) (рис. 6A) или только M _r. -зависимые на молярном уровне соответственно.

В настоящем исследовании сравнивались в первую очередь равные гравиметрические концентрации SG, поскольку точные молярные концентрации не могут быть определены из-за присущей гликанов полидисперсности.Однако это может быть связано с недооценкой роли M _r , как показали дополнительные эксперименты с использованием примерно одинаковых молярных концентраций. Согласно этим тестам, также активность SG с DS ≥ 1,34 улучшалась с увеличением M _r (по крайней мере до M _r 70 000). Тем не менее такая противоречивая зависимость M _r подтверждает его подчиненную роль для SG с более высокой DS. Частично это может быть связано с изменением стехиометрии молекулярного взаимодействия, т.е.е. одна длинная цепь SG может связываться более чем с одной парой C1-INH / C1, тогда как аффинность связывания не увеличивается дальше определенной длины цепи.

Таким образом, потенцирующая активность C1-INH улучшается с увеличением M _r SG, в результате чего его влияние становится решающим, если DS ниже значения в диапазоне 1,2, как предполагают данные по гепаринам и β-1, Сульфаты 3-глюкана. Таким образом, высокий M _r может компенсировать низкий DS. Такое ограниченное значение M _r согласуется с предложенным сэндвич-механизмом для потенцирования C1-INH [49].

Компенсирующий эффект высокого M _r подтверждается SG, полученным из водорослей, имеющим DS <1,0 (рис. 7): потенцирование C1-INH на S . л .-SP # 1 (DS 0.58, M _r 534 000) и S . l .-SP # 2 (DS 0.35, M _r 541 000) был подобен таковому для UFH, а SG для других полученных из водорослей SG был в диапазоне от LMWH. Примечательно, что SG из высокомолекулярных водорослей с DS <0,5 ( S . l .-СП №2, С . t .-SP) проявляли активность, тогда как ГАГ с DS <0,5 и M _r <80 000 были неактивными (рис. 4).

Более того, активность частично деполимеризованных фукозосодержащих сульфатированных полисахаридов улучшалась с увеличением M _r . Но в соответствии с результатами для гепаринов и сульфатов β-1,3-глюкана, очевидно, существует определенный верхний предел, который различается в зависимости как от DS, так и от основы сравнения (гравиметрические и молярные концентрации) (рис. 2).В случае очень слабосульфатированного S . l .-SP, плато активности наблюдается только при M _r > 200 000 (молярное сравнение).

Усиливающая активность C1-INH тестируемых SG в зависимости от их M _r суммирована на рис. 13.

Рис. 13. Полный обзор потенцирующей активности тестируемых сульфатированных гликанов на ингибирование C1s ингибитором C1 в зависимости от их молекулярной массы.

Усиление C1-INH (%) сульфатированными гликанами (конечная концентрация: 6.25 мкг / мл) тестировали с помощью анализа хромогенного субстрата. Цифры в скобках показывают степень сульфатирования соединения. Представленные данные были получены с той же партией C1-INH, за исключением S . л . -СП №2 и С . т .-СП. Среднее значение ≥ 3 тестов в разные дни.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0165493.g013

Усиление ингибитора С1 в зависимости от степени сульфатирования.

В соответствии с более ранними выводами Wuillemin et al.[28], неактивность двух декстранов (рис. 5) показала, что присутствие сульфатных групп существенно для потенцирования C1-INH гликанами. Активности соединений внутри каждой серии SG (гепарины, гепарансульфаты, хондроитинсульфаты, PhyS, S . l .-SP, F . v .-SP, сульфатированные ксилогалактаны ( D . ) s .-SP, C . t .-SP)) выявили корреляцию между DS и активностью (Рис. 3, Рис. 4, Рис. 7).Сходная активность PhyS3 (DS 1.80), PhyS4 (DS 2.21) и PhyS5 (DS 3.00) предполагает определенный верхний предел для DS-зависимого увеличения активности, на который, однако, дополнительно влияет M _r и, возможно, дальнейшее структурные параметры. Минимальная DS для любой активности, как оказалось, зависела как от M _r , так и от структуры гликана и широко варьировала от 0,34 ( S , l .-SP # 2) до 1,6 (FPX) среди протестированных SG.

Поразительно, но некоторые SG с DS <0.5 (от O sUFH, CS-A, CS-B, CS-C, HS33-04), а также PhyS1 (DS 0,75) немного, но воспроизводимо ослабляли эффект C1-INH по отношению к C1s. Уже Rent et al. обнаружили уменьшение эффекта C1-INH хондроитинсульфатом А при концентрациях до 100 мкг / мл и только усиление при 1000 мкг / мл [26]. Более чем в 10 раз более высокое сродство гепарина к C1-INH (K _D 16,7 x 10 ⁻⁸ M) по сравнению с C1s (K _D 108 x 10 ⁻⁸ M), как определено с помощью поверхностного плазмонного резонанса. [32] может дать объяснение этому явлению: плотность заряда SG с DS <0.5 может быть слишком низким для одновременного связывания с C1-INH и C1s и образования сэндвич-комплекса, но достаточным для единственного связывания SG с C1-INH, что приводит к определенному нарушению образования комплекса между C1-INH и C1s. Двойное связывание и, следовательно, усиление может быть достигнуто только с помощью высоких концентраций или очень длинных цепей SG, таких как S . л .-СП.

На данный момент практически нет данных о том, усиливают ли другие полианионы, кроме SG, C1-INH. Ранние эксперименты, проведенные с сывороткой вместо C1-INH, выявили умеренное усиление ингибирования C1s поливинилсульфонатом, тогда как полиантолсульфонат натрия (Liquoid ^® , Grobax ^® ) нейтрализовал ингибирующее действие C1s сывороткой [26].Мы смогли подтвердить, что структура гликана не важна, протестировав сурамин, симметричную молекулу, состоящую из четырех бензольных единиц и двух нафталина, замещенных шестью сульфонатными группами (M _r 1 429). Но в свете его умеренной активности примерно 20% потенцирования C1-INH при 6,25 мкг / мл (4,37 мкмоль / л) по сравнению с почти максимальным потенцированием только на 0,625 мкг / мл (0,07 мкмоль / л) PhyS3, гликановые структуры могут быть больше. подходит для усиления действия C1-INH. Сообщалось, что полифосфат, то есть линейные полимеры ортофосфата (NaPO ₃ ), связанные фосфоангидридными связями, связываются с C1-INH [54], и только что опубликованные данные демонстрируют усиливающую активность C1-INH полифосфата, состоящего из 130 единиц [55] .Однако, основываясь на испытанных гравиметрических и молярных концентрациях, его действие было значительно слабее, чем у гепарина. Это согласуется с нашими предварительными данными по курдланфосфату (-2,4 ± 1,8% потенцирования C1-INH при конечной концентрации 6,25 мкг / мл), что указывает на то, что фосфатные группы могут быть менее склонны, чем сульфатные группы, к созданию сэндвич-комплекса для потенцирования. Точно так же уроновые кислоты, которые составляют 50% моносахаридов ГАГ, по-видимому, вносят лишь небольшой вклад в усиление C1-INH, что следует из небольшой потенцирующей активности как HA, так и oligoHA.Очевидно противоречивый эффект альгината натрия (-5,1 ± 1,1% потенцирования C1-INH при конечной концентрации 6,25 мкг / мл) можно объяснить его упорядоченной конформацией из-за образования комплекса (модель яичной коробки) в присутствии Ca ^{. 2+} и Mg ²⁺ [56], которые могут предотвратить образование сэндвич-комплексов.

Усиливающая активность C1-INH тестируемых SG в зависимости от их DS представлена ​​на рис. 14.

Рис. 14. Полный обзор потенцирующей активности тестируемых сульфатированных гликанов на ингибирование C1s ингибитором C1 в зависимости от степени их сульфатирования.

Усиление C1-INH (%) сульфатированными гликанами (конечная концентрация: 6,25 мкг / мл) тестировали с помощью анализа хромогенного субстрата. Цифры в скобках показывают молекулярную массу соединения, M _r (10 ³ ). Представленные данные были получены с той же партией C1-INH, за исключением S . л . -СП №2 и С . т .-СП. Среднее значение ≥ 3 тестов в разные дни.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0165493.g014

Усиление ингибитора C1 в зависимости от структуры гликана.

Сложность рисунков 13 и 14 показывает, что потенцирующая активность C1-INH тестируемых SG зависит не только от их DS и M _r , но также и от их гликановой структуры. Сравнение SG с разными структурами, но либо схожей активностью, либо подходящими DS и M _r (таблица 3) позволяет предположить следующие эффекты гликановой структуры на потенцирующую активность C1-INH: (1) OSHep был более активен, чем OSCS, несмотря на его некоторые более низкие DS и M _r .Это может быть связано с высоким содержанием идуроновой кислоты в гепаринах, тогда как хондроитинсульфаты содержат исключительно глюкуроновую кислоту. Уникальной особенностью идуроновой кислоты является ее конформационная гибкость, которая считается полезной для взаимодействия с биомолекулами [57]. (2) CurS1 был таким же активным, как DexS-H, имеющий на 2,4 таймера более высокий DS, а PhyS2 (DS 1,48) был более активен, чем DexS-L (DS 2,02), так что линейная структура β-1,3-глюкана, по-видимому, более подходит для образования сэндвич-комплексов, чем декстран с сильно разветвленной α-1,6-глюкановой структурой.(3) Как показывает превосходство PhyS2 и PhyS3 над OSHep, предполагается, что структура β-1,3-глюкана также более благоприятна, чем у гепаринов, причем это также может быть связано с их гомогенным составом, тогда как гепарины состоят из сложной смеси гетерогенных молекул [57]. (4) Среди SG, полученных из водорослей, фукозосодержащие сульфатированные полисахариды (син. Фукоиданы) из бурых водорослей оказались лучшими модуляторами C1-INH, чем ксилогалактаны из красных водорослей. Об этом свидетельствует более высокая активность низкосульфатированного деполимеризованного S . l . -SP # 2 образцы по сравнению с C . т . — SP и D . s .-SP, а также F . v .-SP # b, который был так же активен, как D . s .-SP несмотря на его нижние M _r и DS (Таблица 3) _.

FXIIa, ингибитор C1 и сульфатированные гликаны

Состояние исследований.

Испытанные SG продемонстрировали сильно различающиеся эффекты на взаимодействие C1-INH-C1s, начиная от определенной нейтрализации C1-INH до потенцирования, более сильного, чем у декстрансульфатов, которые до сих пор были описаны как наиболее сильнодействующие соединения [28].Поэтому возник вопрос, как эти SG модулируют взаимодействия C1-INH с другими сериновыми протеазами.

Из них FXIIa оказался наиболее интересным, поскольку он инициирует не только контактную активацию, но также запускает опосредованную C1 активацию комплемента [2,58,38] и преимущественно ингибируется C1-INH, подобным C1s [47 , 48]. Более того, было обнаружено, что влияние ГАГ на реакцию C1-INH-FXIIa [36,34] отличается от влияния на C1-INH-C1s [28], C1-INH-FXIa [34,35] и C1-INH- калликреин [37,34].ГАГ и декстрансульфаты (в порядке декстрансульфат> гепарин> гепаринсульфат; низкомолекулярный декстрансульфат> НМГ> дерматансульфат) сильно ускоряли ингибирование FXIa, аналогичное ингибированию C1s [34,35], а декстрансульфат увеличивал FXIa. — ингибирование C1-INH в плазме от 44% до 99%, тогда как все эти SG существенно не изменяли активность калликреина [34,37]. На инактивацию FXIIa под действием C1-INH также не влияли гепарины, гепарансульфат и дерматансульфат, а, наоборот, некоторые полианионы (высокомолекулярный и низкомолекулярный декстрансульфат, чрезвычайно высокая концентрация гепарина (400 мкг / мл). ), каолин и сульфатиды), как сообщалось, защищают FXIIa от ингибирования C1-INH [36,34,35].

Прямая модуляция активности FXIIa, независимая от ингибитора C1.

Частично наши первоначальные результаты, казалось, подтверждали отчетливые эффекты SG на ингибирование FXIIa с помощью C1-INH, а именно отсутствие значительного изменения под действием UFH и ослабление активности C1-INH с помощью очень высокомолекулярной массы S . л .-SP до полного восстановления активности FXIIa. Однако поразительно то, что полусинтетические β-1,3-глюкановые сульфаты PS3 и CurS3, по-видимому, усиливали C1-INH. В конечном счете, эта уникальная активность была обусловлена ​​прямым ингибированием амидолитической активности FXIIa, так что улучшенное ингибирование FXIIa с помощью C1-INH было результатом аддитивного эффекта.Насколько нам известно, такого прямого влияния на FXIIa раньше не наблюдалось. До сих пор было описано, что декстрансульфат и ГАГ непосредственно влияют только на амидолитическую активность калликреина и FXIa [34,35,59], а также снижают каталитическую активность калликреина в отношении гидролиза плазминогена [37].

Более того, снижение ингибирования FXIIa с помощью C1-INH в присутствии S . Было показано, что -1, .-SP и другие SG возникают не из-за защиты FXIIa от инактивации, как предполагалось ранее [36,34,28], а из-за прямой стимуляции его амидолитической активности.

Beinrohr et al. [49] предположили, что усиливающая активность полианионов C1-INH коррелирует с положительными зарядами на сайте контакта сериновых протеаз. Соответственно, наиболее значительный эффект наблюдается, когда FXIa несет наибольшее количество положительных зарядов, тогда как чрезвычайно кислый FXIIa предотвращает образование сэндвич-комплекса и даже ухудшает инактивацию C1-INH. Однако эта гипотеза противоречит не только нашим наблюдениям за прямым влиянием SG на активность FXIIa, но также и идентифицированному сайту связывания FXII для отрицательно заряженных поверхностей на фибронектиновом домене типа II FXII, в частности остатках с 39 по 47 [60 ] и обнаруженное связывание OSCS как с FXII, так и с FXIIa [61].

Структурно-зависимая модуляция активности FXIIa с помощью сульфатированных гликанов.

Хотя принцип действия SG на FXIIa требует дальнейшего изучения, например Исследования в более физиологической системе, тестирование значительного количества SG предоставили следующую информацию о взаимосвязях структура-активность.

Тип модуляции решительно определялся DS: (1) Все испытанные SG с DS ≥ 1,35 ингибировали FXIIa с оптимумом при DS 1,8–2,2, при этом максимальное ингибирование наблюдалось при 6.12 мкг / мл и не превышала примерно 60%. (2) Гепарины, то есть SG с DS около 1,0, существенно не модулируют активность FXIIa. (3) Все протестированные SG с DS ≤ 0,80 стимулировали активность FXIIa примерно на 40%, достигаемую HS11-08 (DS 0,80, M _r 10 800) и S . л .-СП №1 (ДС 0.58, М _r 534 000).

Помимо DS, свою роль сыграл M _r SG. FXIIa, стимулирующий SG с Mr ≤ 150 000, как и HS11-08, проявлял зависящее от концентрации увеличение активности (самая высокая концентрация 12.5 мкг / мл), тогда как более крупные, например S . l .-SP # 1, отображала колоколообразную кривую с максимальной стимуляцией при 1,25 мкг / мл. В случае соединений с высоким содержанием сульфатов, ингибирующих FXIIa, соединения с высоким M _r (DexS-H, CurS) показали стимулирующий эффект при самой низкой концентрации (0,125 мкг / мл).

В целом, только высокосульфатированный SG с ограниченным количеством M _r , подобный PhyS, явно ингибирует FXIIa до определенной степени, тогда как и низкосульфатированный SG, и большой SG, по-видимому, способны проявлять стимулирующие эффекты FXIIa в зависимости от их концентрации.

Хорошо известно, что отрицательно заряженные поверхности вызывают аутоактивацию FXII, но до сих пор не сообщалось о стимулирующем эффекте на активность FXIIa. Примечательно, что недавнее исследование продемонстрировало, что FXII в присутствии полифосфатов (polyP) (scFXII-polyP70) развивает способность гидролизовать хромогенный субстрат, а также его природные субстраты FXI и прекалликреин, не превращаясь в двухцепочечный фермент и, следовательно, FXIIa. [62]. Было показано, что связывание полиР является важным для этой активности, и была очевидна колоколообразная концентрационная реакция на полиР, что типично для опосредованных поверхностью реакций.Соответственно, можно предположить, что также связывание SG с FXIIa может индуцировать или стабилизировать конформацию FXIIa, оптимальную для его ферментативной активности.

Какое влияние наблюдаемые прямые эффекты SG на активность FXIIa оказывают в более физиологических системах, еще предстоит исследовать. Это трудно оценить из-за (пато-) физиологической комплексной роли FXII / FXIIa (коагуляция, прекалликреин (образование брадикинина) и активация комплемента), его регуляции несколькими эндогенными ингибиторами [47] и поливалентного взаимодействия SG с вовлеченными ферментами. и ингибиторы.Более того, SG может вызывать аутоактивацию FXII [63] (например, PhyS ≤ heparins in vitro . Это иллюстрируется OSCS, неправильно используемым для фальсификации гепарина, который проявляет как анти-, так и прокоагулянтное действие, а также активирует и ингибирует комплемент in vitro [61, 64, 30]. Неблагоприятные клинические явления, наблюдаемые при применении гепарина, загрязненного OSCS, были связаны с активацией кинин-калликреиновых путей и путей комплемента [64].Однако у большинства пациентов, получавших зараженный гепарин, побочных эффектов не наблюдалось. Чтобы прояснить этот факт, было проведено исследование, включающее анализ данных пациентов и образцов плазмы [65]. Было обнаружено, что низкие уровни C1-INH оказались фактором риска для побочных эффектов, тогда как высокие уровни были предложены как защитные, что еще раз подчеркивает важность соответствующей функции C1-INH.

Заключение

Таким образом, оцененные взаимосвязи структура-активность показывают, что потенцирующий эффект SG на ингибирование C1s с помощью C1-INH коррелирует с их DS и M _r , но дополнительно зависит от их гликановой структуры.Зависимость от DS и M _r тесно связаны, что означает, что M _r играет особенно важную роль, если DS ниже ~ 1,2. И минимальный M _r , необходимый для любого усиления слабосульфатированным SG, и верхний предел M _r , все еще имеющий влияние, увеличиваются с уменьшением DS SG. Соответственно, SG с очень низким DS требует высокого M _r для проявления любого потенцирования C1-INH, тогда как для SG с очень высоким DS длина цепи всего 5 моносахаридов (FPX) оказалась достаточной для небольшого эффекта. .Эти наблюдения согласуются с сэндвич-механизмом, согласно которому полианион выступает в качестве отрицательно заряженного моста между положительно заряженными поверхностями C1-INH и C1s [50,49]. Среди структур гликанов, изученных в этом исследовании in vitro , как β-1,3-глюканы, так и гликаны, богатые фукозой, оказались благоприятными структурами для потенцирования C1-INH.

В отличие от взаимодействия C1-INH-C1s, SG не влияет на взаимодействие C1-INH-FXIIa, но SG с DS и M _r , значительно отличающиеся от взаимодействия гепаринов, могут напрямую модулировать активность FXIIa.В то время как SG с DS <1.0, как оказалось, стимулирует активность FXIIa колоколообразным образом, SG с DS> 1.0 в зависимости от концентрации ингибирует активность FXIIa до определенной степени. Однако, особенно в случае FXIIa с его сложными функциями и регуляцией, SG может дополнительно модулировать другие ферменты и ингибиторы, участвующие в этой сети. Следовательно, необходимы дальнейшие исследования, в результате которых OSCS, загрязняющий гепарин, продемонстрировал, что конечный результат in vivo вряд ли возможен из исследований in vitro и .

Как обычно при разработке лекарств, важным предварительным условием использования SG в качестве усилителя C1-INH является его безопасность. В этом отношении соответствующий SG не должен ни стимулировать FXIIa, ни запускать автоактивацию FXII, как это известно из полианионов с высоким M _r [63]. Поскольку SG обычно действуют как поливалентные биомодуляторы [53] и могут проявлять дополнительную активность в зависимости от своих структурных параметров, необходимо учитывать общий фармакологический профиль. Как правило, SG, подходящие для использования в качестве усилителей C1-INH, должны обладать меньшим антикоагулянтом, чем гепарины.Предполагается, что дополнительная противовоспалительная активность будет полезной. Учитывая снижение побочных эффектов (например, гепарин-индуцированную тромбоцитопению) [66] и улучшенную фармакокинетику НМГ по сравнению с НФГ [53], довольно низкий M _r считается преимуществом для in vivo применимого SG.

Принимая во внимание эти аспекты, а также результаты настоящего исследования, PhyS, то есть низкомолекулярные β-1,3-глюкановые сульфаты, могут представлять собой многообещающие кандидаты для дальнейших исследований.По сравнению с гепаринами и другими ГАГ, PhyS имеет то преимущество, что они представляют собой полусинтетические гликаны неживотного происхождения с определенным химическим составом. Хотя было доказано, что PS3 обладает выраженным противовоспалительным действием in vivo и [42,67], PhyS с более низким DS может быть более подходящим для использования в качестве усилителя C1-INH. Кроме того, деполимеризованные сульфатированные гликаны, богатые фуканом, по-видимому, заслуживают более подробной оценки в качестве основных структур.

В заключение, результаты этого исследования представляют собой основную фармакологическую информацию, которая может быть полезна для начальных шагов по разработке соединений, усиливающих C1-INH для улучшения текущей заместительной терапии C1-INH или повышения эффективности эндогенного C1-INH при заболеваниях и заболеваниях. клинические ситуации, характеризующиеся несоответствующей активацией комплементарной и контактной системы.

Дополнительная информация

S1 Рис. Сульфатированные гликаны не ингибируют напрямую C1s эстеразу.

Активность C1s в отсутствие (= 100% активность) и в присутствии тестируемых соединений (конечная концентрация: 6,25 мкг / мл) измеряли с помощью анализа хромогенного субстрата. Среднее значение ± стандартное отклонение (n ≥ 3 тестов в разные дни).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0165493.s001

(TIF)

S2 Рис. C1 Усиление ингибитора гепаринами с аналогичной степенью сульфатирования зависит от их молекулярной массы.

Активность C1s измеряли в присутствии C1-INH и различных гепаринов (конечная концентрация: 6,25 мкг / мл) с помощью анализа хромогенного субстрата. Усиление C1-INH (%) представляет собой увеличение ингибирования C1s в присутствии тестируемого соединения по сравнению с ингибированием C1s посредством C1-INH. Среднее значение ± стандартное отклонение (n ≥ 4 тестов в разные дни).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0165493.s002

(TIF)

S3 Рис. Ингибирование FXIIa ингибитором C1 в зависимости от времени инкубации.

FXIIa инкубировали с C1-INH в течение от 0 до 60 минут при 37 ° C и его амидолитическую активность измеряли с помощью S-2302. Ингибирование FXIIa (%) рассчитывали по отношению к активности FXIIa в отсутствие одного C1-INH. Среднее значение ± стандартное отклонение (n ≥ 3 тестов в разные дни).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0165493.s003

(TIF)

Благодарности

Мы благодарим доктора Карину Эриг и Джулиану Гримм за предоставление и описание сульфатированных гликанов, полученных из Saccharina latissima L.и Delesseria sanguinea / Coccotylus truncatus соответственно.

Вклад авторов

1. Концептуализация: SA.
2. Формальный анализ: AS SA.
3. Расследование: AS EL.
4. Методология: SA AS.
5. Ресурсы: SA EL.
6. Надзор: SA.
7. Визуализация: AS.
8. Написание — черновик: AS SA.
9. Написание — просмотр и редактирование: SA AS.

Список литературы

1. 1.
   Davis AE 3rd, Lu F, Mejia P. Ингибитор C1, многофункциональный ингибитор сериновой протеазы. Тромбоз и гемостаз. 2010; 104 (5): 886–893. pmid: 20806108.
2. 2.
   Конвей Э.М. Реинкарнация древних связей между свертыванием и комплементом. Журнал тромбоза и гемостаза. 2015; 13 (Дополнение 1): 121–132. pmid: 26149013.
3. 3.
   Мелис Дж. П., Струман К., Руулс С. Р., Бюрскенс Ф. Дж., Шуурман Дж., Паррен П. У.Дополнение к терапии и болезни. Регулирование системы комплемента с помощью терапевтических средств на основе антител. Молекулярная иммунология. 2015; 67 (2): 117–130. pmid: 25697848.
4. 4.
   Мамиди С., Хон С., Киршфинк М. Система комплемента при раке: амбивалентность между разрушением и продвижением опухоли. Иммунобиология. 2015; pmid: 26686908.
5. 5.
   Харбо М, Моллнес Т.Э. Еще раз об альтернативном пути комплемента. Журнал клеточной и молекулярной медицины. 2008; 12 (4): 1074–1084.pmid: 18419792.
6. 6.
   Сим РБ, Ребул А, Арлауд Дж.Дж., Вилльерс К.Л., Коломб МГ. Взаимодействие 125I-меченных подкомпонентов комплемента C-1r и C-1s с ингибиторами протеаз в плазме. Письма FEBS. 1979; 97 (1): 111–115. 761607. pmid: 761607
7. 7.
   Matsushita M, Thiel S, Jensenius JC, Terai I, Fujita T. Протеолитическая активность двух типов маннозо-связывающей лектин-ассоциированной сериновой протеазы. Журнал иммунологии. 2000; 165 (5): 2637–2642. pmid: 10946292.
8. 8.
   Керр Ф.К., Томас А.Р., Wijeyewickrema LC, Whisstock JC, Boyd SE, Kaiserman D и др. Выяснение субстратной специфичности протеазы MASP-2 лектинового пути комплемента и идентификация фермента как основной физиологической мишени серпина, ингибитора C1. Молекулярная иммунология. 2008; 45 (3): 670–677. pmid: 17709141.
9. 9.
   Jiang H, Wagner E, Zhang H, Frank MM. Ингибитор комплемента 1 является регулятором альтернативного пути комплемента.Журнал экспериментальной медицины. 2001; 194 (11): 1609–1616. pmid: 11733575.
10. 10.
    Дэвис А.Е. 3-й, Мейя П., Лу Ф. Биологическая активность ингибитора С1. Молекулярная иммунология. 2008; 45 (16): 4057–4063. pmid: 18674818.
11. 11.
    Zeerleder S, Levi M. Наследственный и приобретенный C1-ингибитор-зависимый ангионевротический отек: от патофизиологии к лечению. Летопись медицины. 2016; 48 (4): 256–267. pmid: 27018196.
12. 12.
    Лю К., Лай ТЫЙ, Ма Л., Лай ФХП, Янг А.Л., Брелен М.Э. и др.Этнические различия в связи SERPING1 с возрастной дегенерацией желтого пятна и полипоидной хориоидальной васкулопатией. Научные отчеты. 2015; 5: 9424. pmid: 25800435.
13. 13.
    Боуэн Б., Хок Дж. Дж., Сибунка С., Ховик С., Вейлер Дж. М.. Обзор зарегистрированных дефектов гена ингибитора C1-эстеразы человека, вызывающего наследственный ангионевротический отек, включая четыре новые мутации. Клиническая иммунология. 2001; 98 (2): 157–163. pmid: 11161971.
14. 14.
    Dewald G, Bork K. Миссенс-мутации в гене фактора свертывания XII (фактор Хагемана) при наследственном ангионевротическом отеке с нормальным ингибитором C1.Сообщения о биохимических и биофизических исследованиях. 2006; 343 (4): 1286–1289. pmid: 16638441.
15. 15.
    Cichon S, Martin L, Hennies HC, Muller F, van Driessche K, Karpushova A и др. Повышенная активность фактора свертывания крови XII (фактор Хагемана) вызывает наследственный ангионевротический отек III типа. Американский журнал генетики человека. 2006; 79 (6): 1098–1104. pmid: 17186468.
16. 16.
    Caccia S, Suffritti C, Cicardi M. Патофизиология наследственного ангионевротического отека. Детская аллергия, иммунология и пульмонология.2014; 27 (4): 159–163. pmid: 25538858.
17. 17.
    Дэвис А.Е. 3-й. Патогенез наследственного отека Квинке. Наука о переливании и аферезе. 2003; 29 (3): 195–203. pmid: 14572810
18. 18.
    Greve J, Strassen U, Gorczyza M, Dominas N, Frahm UM, Muhlberg H и др. Профилактика наследственного ангионевротического отека (НАО) с дефицитом ингибитора С1. Журнал Немецкого общества дерматологов. 2016; 14 (3): 266–275. pmid: 26972189.
19. 19.
    Европейское агентство по лекарственным средствам (EMA).Руконест, конестат альфа. Отчет об оценке общественности Европы (EPAR). Доступно: http://www.ema.europa.eu/ema/index.jsp?curl=pages/medicines/human/medicines/001223/human_med_001382.jsp&mid=WC0b01ac058001d124. По состоянию на 7 июля 2016 г.
20. 20.
    Европейское агентство по лекарственным средствам (EMA). Фиразыр, икатибант. Отчет об оценке общественности Европы (EPAR). Доступно: http://www.ema.europa.eu/ema/index.jsp?curl=pages/medicines/human/medicines/000899/human_med_000793.jsp&mid=WC0b01ac058001d124. По состоянию на 7 июля 2016 г.
21. 21.
    Оттава (ON): Канадское агентство по лекарствам и технологиям в области здравоохранения. Ингибитор эстеразы C1 для профилактики наследственных приступов ангионевротического отека: обзор клинической эффективности, рентабельности и рекомендаций. Отчеты быстрого реагирования CADTH. 2015; 24 апреля 2015 г. 26180896.
22. 22.
    Петрароли А., Скеглия В., Ди Паола Н., Барбарино А., Бова М., Спано Р. и др. Домашняя терапия с плазменным ингибитором C1: стратегия улучшения клинических результатов и затрат при наследственном ангионевротическом отеке.Международный архив аллергии и иммунологии. 2015; 166 (4): 259–266. pmid: 25

2.

23. 23.
    Расмуссен Э.Р., Агард Л., Бигум А. Практический опыт длительного профилактического лечения пациентов с наследственным ангионевротическим отеком: эффективность и стоимость. Анналы аллергии, астмы и иммунологии. 2016; 116 (5): 476–477. pmid: 27017563.
24. 24.
    Певица М., Джонс А.М. Прикроватный осмотр: роль ингибитора С1-эстеразы при сепсисе и других критических заболеваниях.Критическая помощь. 2011; 15 (1): 203. pmid: 21345278.
25. 25.
    Begieneman MP, Emmens RW, Rijvers L., Woudstra L, Paulus WJ, Kubat B, et al. Инфаркт миокарда вызывает воспаление предсердий, которое можно предотвратить с помощью ингибитора C1-эстеразы. Журнал клинической патологии. 2016; pmid: 27153875.
26. 26.
    Рент Р., Мирман Р., Фидель А., Гевурц Х. Усиление активности ингибитора С1-эстеразы гепарином. Клиническая и экспериментальная иммунология. 1976; 23 (2): 264–271. PMCID: PMC1538461.
27. 27.
    Videm V, Mollnes TE, Bergh K, Fosse E, Mohr B, Hagve T.-A и др. Аппарат искусственного кровообращения, покрытый гепарином. II. Механизмы снижения активации комплемента in vivo. Журнал торакальной и сердечно-сосудистой хирургии. 1999; 117 (4): 803–809. pmid: 10096977.
28. 28.
    Wuillemin WA, te Velthuis H, Lubbers YT, Ruig CP de, Eldering E, Hack CE. Усиление ингибитора С1 гликозаминогликанами. Виды декстрансульфата являются эффективными ингибиторами активации комплемента in vitro в плазме.Журнал иммунологии. 1997; 159 (4): 1953–1960. pmid:
    61.
29. 29.
    Колдуэлл EEO, Андресен А.М., Блитц М.А., Серран Дж. Н., ВандерНут V, Парк Y и др. Связывание гепарина и усиление активности ингибитора С1. Архивы биохимии и биофизики. 1999; 361 (2): 215–222. pmid: 9882449.
30. 30.
    Zhou Z-H, Rajabi M, Chen T., Karnaukhova E, Kozlowski S. Избыточный сульфат хондроитина ингибирует классический путь комплемента, усиливая ингибитор C1.PLoS One. 2012; 7 (10): e47296. pmid: 23077587.
31. 31.
    Tissot B, Montdargent B, Chevolot L, Varenne A, Descroix S, Gareil P и др. Взаимодействие фукоидана с белками классического пути комплемента. Biochimica et Biophysica Acta — Белки и протеомика. 2003; 1651 (1–2): 5–16. pmid: 14499584.
32. 32.
    Росси В., Балли I, Анселет С., Сюй У., Фремо-Бакки В., Вивес Р. Р. и др. Функциональная характеристика серпинового домена рекомбинантного человеческого ингибитора C1: понимание связывания гепарина.Журнал иммунологии. 2010; 184 (9): 4982–4989. pmid: 20351192.
33. 33.
    Poppelaars F, Damman J, Vrij EL de, Burgerhof JG, Saye J, Daha MR, et al. Новое понимание влияния гепариноидов на ингибирование комплемента С1-ингибитором. Клиническая и экспериментальная иммунология. 2016; 184 (3): 378–388. pmid: 26874675.
34. 34.
    Wuillemin WA, Eldering E, Citarella F, Ruig CP de, Cate H ten, Hack CE. Модуляция протеаз контактной системы гликозаминогликанами. Избирательное усиление ингибирования фактора XIa.Журнал биологической химии. 1996; 271 (22): 12913–12918. pmid: 8662679.
35. 35.
    Mauron T, Lämmle B, Wuillemin WA. Влияние низкомолекулярного гепарина и низкомолекулярного сульфата декстрана на ингибирование фактора свертывания крови XIa серпинами. Тромбоз и гемостаз. 1998; 80 (1): 82–86. pmid: 9684790.
36. 36.
    Пиксли Р.А., Шмайер А., Колман Р.В. Влияние отрицательно заряженных активирующих соединений на инактивацию фактора XIIa ингибитором Cl.Архивы биохимии и биофизики. 1987; 256 (2): 490–498. pmid: 3497611.
37. 37.
    Gozzo AJ, Nunes VA, Nader HB, Dietrich CP, Carmona AK, Sampaio MU и др. Гликозаминогликаны влияют на взаимодействие калликреина плазмы человека с плазминогеном, фактором XII и ингибиторами. Бразильский журнал медико-биологических исследований. 2003; 36 (8): 1055–1059. pmid: 12886459.
38. 38.
    Гебрехивет Б., Рандаццо Б. П., Данн Дж. Т., Сильверберг М., Каплан А. П.. Механизмы активации классического пути комплемента фрагментом фактора Хагемана.Журнал клинических исследований. 1983; 71 (5): 1450–1456. pmid: 6304147.
39. 39.
    Маруяма Т., Тойда Т., Иманари Т., Ю.Г., Линхардт Р.Дж. Конформационные изменения и антикоагулянтная активность хондроитинсульфата после его O-сульфирования. Углеводные исследования. 1998; 306 (1–2): 35–43. pmid: 96.
40. 40.
    EDQM. Европейская фармакопея — монография Danaparoid Sodium 8.0 / 2090. Страсбург: EDQM; 2013.
41. 41.
    Альбан С., Франц Г. Анализ газожидкостной хроматографии и масс-спектрометрии антикоагулянтных активных сульфатов курдлана.Семинары по тромбозу и гемостазу. 1994; 20 (2): 152–158. pmid: 7997886.
42. 42.
    Yvin J-C, Alban S, Franz G. Противовоспалительное и лечебное средство на основе сульфата ламинарина. US 7008931-B2 (07.03.2006), EP1337261-B1 (21.03.2007).
43. 43.
    Альбан С., Франц Г. Частичные синтетические сульфаты глюкана как новые потенциальные антитромботики: обзор. Биомакромолекулы. 2001; 2 (2): 354–361. pmid: 11749192.
44. 44.
    Эриг К., Албан С. Сульфатированный галактофукан из бурой водоросли Saccharina latissima — изменчивость урожайности, структурного состава и биоактивности.Морские препараты. 2015; 13 (1): 76–101. pmid: 25548975.
45. 45.
    Грюневальд Н., Албан С. Оптимизированное и стандартизованное выделение и структурная характеристика противовоспалительных сульфатированных полисахаридов из красной водоросли Delesseria sanguinea (Hudson) Lamouroux (Ceramiales, Delesseriaceae). Биомакромолекулы. 2009; 10 (11): 2998–3008. pmid: 19795906.
46. 46.
    Албан С., Скриба GKE. Комментарий к монографии «Данапароид натрия» Ph. Eur. 5.5, 2090. 26 изд. Эшборн: Гови; 2007 г.
47. 47.
    Schmaier AH, McCrae KR. Система калликреин-кинин плазмы: ее эволюция от контактной активации. Журнал тромбоза и гемостаза. 2007; 5 (12): 2323–2329. pmid: 17883591.
48. 48.
    Schmaier AH. Контактная активация и системы калликреин / кинин: патофизиологическая и физиологическая активность. Журнал тромбоза и гемостаза. 2016; 14 (1): 28–39. pmid: 26565070.
49. 49.
    Beinrohr L, Harmat V, Dobó J, Lörincz Z, Gál P, Závodszky P.Структура домена серпина ингибитора C1 раскрывает вероятный механизм потенцирования гепарина и конформационных заболеваний. Журнал биологической химии. 2007; 282 (29): 21100–21109. pmid: 17488724.
50. 50.
    Мюррей-Раст Т.А., Керр Ф.К., Томас А.Р., Ву Т., Юнцин Т., Онг П.С. и др. Модуляция протеолитической активности протеазы комплемента C1s с помощью полианионов: значение для опосредованного полианионами ускорения взаимодействия между C1s и SERPING1. Биохимический журнал. 2009; 422 (2): 295–303.pmid: 19522701.
51. 51.
    Rajabi M, Struble E, Zhou Z, Karnaukhova E. Потенцирование ингибитора C1-эстеразы гепарином и взаимодействия с протеазой C1s по оценке поверхностного плазмонного резонанса. Biochimica et Biophysica Acta — Общие вопросы. 2012; 1820 (1): 56–63. pmid: 22040724.
52. 52.
    Caughman GB, Boackle RJ, Vesely J. Постулируемый механизм усиления гепарином функции ингибитора C1. Молекулярная иммунология. 1982; 19 (2): 287–295. pmid: 7099168.
53. 53.
    Альбан С. Фармакологические стратегии ингибирования активности тромбина. Текущий фармацевтический дизайн. 2008; 14 (12): 1152–1175. pmid: 18473863.
54. 54.
    Уот Дж. М., Фоли Дж. Х., Крисинджер М. Дж., Окариза Л. М., Лей В., Васни Г. А. и др. Полифосфат подавляет комплемент через терминальный путь. Кровь. 2014; 123 (5): 768–776. pmid: 24335501.
55. 55.
    Wijeyewickrema LC, Lameignere E, Hor L, Duncan RC, Shiba T., Travers RJ, et al. Полифосфат представляет собой новый кофактор для регуляции комплемента с помощью серпина, С1-ингибитора.Кровь. 2016; pmid: 27338096.
56. 56.
    Borgogna M, Skjak-Braek G, Paoletti S, Donati I. О начальном связывании альгината ионами кальция. Гипотеза наклонного ящика для яиц. Журнал физической химии Б. 2013; 117 (24): 7277–7282. pmid: 23713959.
57. 57.
    Маллой Б. Структура и физико-химическая характеристика гепарина. В: Lever R, Mulloy B, Page CP (ред.). Справочник по экспериментальной фармакологии. Гепарин — век прогресса. 207-е изд. Берлин, Гейдельберг: Springer; 2012 г.С. 77–98.
58. 58.
    Маркевски М.М., Нильссон Б., Нильссон Экдаль К., Моллнес Т.Э., Ламбрис Дж.Д. Дополнение и коагуляция: незнакомцы или соучастники преступления. Направления иммунологии. 2007; 28 (4): 184–192. pmid: 17336159.
59. 59.
    Танкерсли Д.Л., Алвинг Б.М., Финлейсон Дж.С. Активация фактора XII декстрансульфатом: основа для анализа фактора XII. Кровь. 1983; 62 (2): 448–456. pmid: 61.
60. 60.
    Citarella F, te Velthuis H, Helmer-Citterich M, Взломать CE.Идентификация предполагаемого сайта связывания для отрицательно заряженных поверхностей в домене фибронектина типа II человеческого фактора XII — иммунохимический подход и моделирование гомологии. Тромбоз и гемостаз. 2000; 84 (6): 1057–1065. pmid: 11154114.
61. 61.
    Ли Б., Суван Дж., Мартин Дж. Г., Чжан Ф., Чжан З., Хоппенстедт Д. и др. Взаимодействие сверхсульфатированного хондроитинсульфата с гепарин-связывающими белками: новые сведения о побочных реакциях загрязненных гепаринов. Биохимическая фармакология.2009; 78 (3): 292–300. pmid: 19389385.
62. 62.
    Энгель Р., Мозг К.М., Пэджет Дж., Лионикиене А.С., Мач Нью-Джерси. Одноцепочечный фактор XII проявляет активность при образовании комплекса с полифосфатом. Журнал тромбоза и гемостаза. 2014; 12 (9): 1513–1522. pmid: 25039405.
63. 63.
    Сильверберг М, Диль С.В. Аутоактивация фактора XII (фактор Хагемана), индуцированная гепарином с низким M _r и сульфатом декстрана. Действие активирующего полианиона M _r .Биохимический журнал. 1987; 248 (3): 715–720. pmid: 2449171.
64. 64.
    Кишимото Т.К., Вишванатан К., Гангули Т., Эланкумаран С., Смит С., Пельцер К. и др. Загрязненный гепарин, связанный с нежелательными клиническими явлениями и активацией контактной системы. Медицинский журнал Новой Англии. 2008; 358 (23): 2457–2467. pmid: 18434646.
65. 65.
    Zhou Z-H, Chen T, Arora K, Hyams K, Kozlowski S. Уровни ингибитора эстеразы комплемента C1, связанные с инфекциями и побочными эффектами, связанными с загрязнением гепарина.PLoS One. 2012; 7 (4): e34978. pmid: 22514695.
66. 66.
    Альбан С. Побочные эффекты гепарина. В: Lever R, Mulloy B, Page CP (ред.). Справочник по экспериментальной фармакологии. Гепарин — век прогресса. 207-е изд. Берлин, Гейдельберг: Springer; 2012. С. 211–263.
67. 67.
    Альбан С., Людвиг Р.Дж., Бендас Г., Шен М.П., ​​Остинг Г.Дж., Радеке Х.Х. и др. PS3, полусинтетический сульфат β-1,3-глюкана, снижает реакцию контактной гиперчувствительности за счет ингибирования функций L- и P-селектина.Журнал следственной дерматологии. 2009; 129 (5): 1192–1202. pmid: 1

    60.

Контактная система при повреждении печени

Активация контактной системы человека на внеклеточных ловушках нейтрофилов — Аннотация — Журнал врожденного иммунитета 2009, Vol. 1, № 3

Журнал врожденного иммунитета

Короткое сообщение

Свободный доступ

J. Врожденный иммунитет 2009; 1: 225–230

.

Абстрактные

Распознавание образов — неотъемлемая часть врожденной иммунной системы.Было показано, что контактная система человека взаимодействует с поверхностью многих бактериальных и грибковых патогенов, и после активации приводит к образованию антимикробных пептидов и провоспалительного медиатора брадикинина. Здесь мы показываем, что помимо этих поверхностей также внеклеточные ловушки нейтрофилов (NET) обеспечивают поверхность, которая позволяет связываться и активировать контактную систему. Кроме того, мы представляем доказательства того, что белок M1, поверхностный белок стрептококка, во взаимодействии с фибриногеном человека запускает полиморфно-ядерные нейтрофилы с образованием NET.

© 2009 S. Karger AG, Базель

Список литературы

1. Бринкманн В., Райхард Ю., Гусманн С., Фаулер Б., Улеманн Ю., Вайс Д.С., Вайнраух Ю., Зихлински А. Нейтрофильные внеклеточные ловушки убивают бактерии. Наука 2004; 303: 1532–1535.

2. фон Кокриц-Бликведе М., Гольдманн О., Тулин П., Хайнеман К., Норрби-Теглунд А., Роде М., Медина Е.: Независимая от фагоцитоза антимикробная активность тучных клеток посредством образования внеклеточной ловушки.Кровь 2008; 111: 3070–3080.

3. Ходзима Ю., Кокрейн К.Г., Виггинс Р.К., Остен К.Ф., Стивенс Р.Л .: Активация контактной (фактор Хагемана) системы плазмы in vitro гепарином и хондроитинсульфатом E. Кровь 1984; 63: 1453–1459.

4. Espana F, Ratnoff OD: Активация фактора Хагемана (фактор XII) сульфатидами и другими агентами в отсутствие протеаз плазмы.J Lab Clin Med 1983; 102: 31–45.

5. Tans G, Griffin JH: Инициирование контактной активации сульфатидами. Adv Exp Med Biol 1983; 156: 63–72.

6. Каннемайер С., Шибамия А., Накадзава Ф., Трусхайм Х., Рупперт С., Маркарт П., Сонг Y, Цима Э., Кеннеркнехт Э., Нипманн М., фон Брюль М.Л., Седдинг Д., Массберг С., Гюнтер А., Энгельманн Б., Прейсснер К.Т.: ​​Внеклеточный РНК представляет собой естественный кофактор прокоагулянта при свертывании крови.Proc Natl Acad Sci USA 2007; 104: 6388–6393.

7. Фрик И.М., Бьорк Л., Хервальд Х .: Двойная роль контактной системы в бактериальном инфекционном заболевании. Тромб Хемост 2007; 98: 497–502.

8. Каннингем М.В.: Патогенез стрептококковых инфекций группы А.Clin Microbiol Rev 2000; 13: 470–511.

9. Herwald H, Cramer H, Mörgelin M, Russell W, Sollenberg U, Norrby-Teglund A, Flodgaard H, Lindbom L, Björck L: белок M, классическая детерминантная бактериальная вирулентность, образует комплексы с фибриногеном, которые вызывают утечку из сосудов. Cell 2004; 116: 367–379.

10. Полман Л.И., Олин А.И., Даренберг Дж., Моргелин М., Котб М., Хервальд Х., Норрби-Теглунд А: Растворимый белок M1 стрептококка pyogenes запускает мощную активацию Т-клеток.Cell Microbiol 2008; 10: 404–414.

11. Mattsson E, Herwald H, Cramer H, Persson K, Sjöbring U, Björck L: Staphylococcus aureus индуцирует высвобождение брадикинина в плазме человека. Infect Immun 2001; 69: 3877–3882.

12. Herwald H, Mörgelin M, Svensson HG, Sjöbring U: Зависимые от цинка конформационные изменения в домене D5 высокомолекулярного кининогена модулируют активацию контакта.Eur J Biochem 2001; 268: 396-404.

13. Fuchs TA, Abed U, Goosmann C, Hurwitz R, Schulze I, Wahn V, Weinrauch Y, Brinkmann V, Zychlinsky A: Новая программа гибели клеток приводит к внеклеточным ловушкам нейтрофилов. J Cell Biol 2007; 176: 231–241.

14. фон Кёкриц-Бликведе М., Гольдманн О., Тулин П., Хайнеманн К., Норрби-Теглунд А., Роде М., Медина Е.: Независимая от фагоцитоза антимикробная активность тучных клеток посредством образования внеклеточной ловушки.Кровь 2008; 111: 3070–3080.

15. Фрик И.М., Окессон П., Хервальд Х., Моргелин М., Мальмстен М., Нэглер Д.К., Бьорк Л.: Контактная система — новая ветвь врожденного иммунитета, генерирующая антибактериальные пептиды. EMBO J 2006; 25: 5569–5578.

16. Leeb-Lundberg LMF, Marceau F, Müller-Esterl W, Pettibone DJ, Zuraw BL: Международный союз фармакологии.XLV. Классификация семейства кининовых рецепторов: от молекулярных механизмов до патофизиологических последствий. Pharmacol Rev 2005; 57: 27–77.

Подробности статьи / публикации

Предварительный просмотр первой страницы

Получено: 18 ноября 2008 г.
Принято: 17 декабря 2008 г.
Опубликовано онлайн: 20 февраля 2009 г.
Дата выпуска: апрель 2009 г.

Количество страниц для печати: 6
Количество рисунков: 3
Количество столов: 0

ISSN: 1662-811X (печать)
eISSN: 1662-8128 (онлайн)

Для дополнительной информации: https: // www.karger.com/JIN

Авторские права / Дозировка препарата / Заявление об ограничении ответственности

Авторские права: Все права защищены. Никакая часть данной публикации не может быть переведена на другие языки, воспроизведена или использована в любой форме и любыми средствами, электронными или механическими, включая фотокопирование, запись, микрокопирование, или с помощью какой-либо системы хранения и поиска информации, без письменного разрешения издателя. .
Дозировка лекарств: авторы и издатель приложили все усилия, чтобы гарантировать, что выбор и дозировка лекарств, указанные в этом тексте, соответствуют текущим рекомендациям и практике на момент публикации.Тем не менее, ввиду продолжающихся исследований, изменений в правительственных постановлениях и постоянного потока информации, касающейся лекарственной терапии и реакций на них, читателю рекомендуется проверять листок-вкладыш для каждого препарата на предмет любых изменений показаний и дозировки, а также дополнительных предупреждений. и меры предосторожности. Это особенно важно, когда рекомендованным агентом является новое и / или редко применяемое лекарство.
Отказ от ответственности: утверждения, мнения и данные, содержащиеся в этой публикации, принадлежат исключительно отдельным авторам и соавторам, а не издателям и редакторам.Появление в публикации рекламы и / или ссылок на продукты не является гарантией, одобрением или одобрением рекламируемых продуктов или услуг или их эффективности, качества или безопасности.